[发明专利]一种利用西洋参内生菌发酵制备溶栓酶的方法

权利要求书

1.一株产溶栓酶的菌株——枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilissp.)CG1，分离自西洋参根部，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏日期为2020年6月19日，保藏编号为CCTCC NO：M2020225。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilissp.)CG1的分离方法，其特征在于，按如下步骤操作：

(1)菌株分离：取西洋参鲜根，去除须根，自来水冲洗5min，用滤纸吸干水分后，用75％乙醇浸泡1min，后用2％NaClO浸泡4min，再用50％乙醇冲洗30s，然后用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干根部表面水分，用无菌剪刀去除表皮及边缘组织后，剪成0.3cm×0.3cm的小块，等间距接入NA、PDA培养基中，分别于37℃、28℃恒温培养箱中倒置培养；

(2)菌株纯化和保藏：待根块边缘长出菌落后，挑取单菌落或孢子，接种于新的平板上培养，如此重复6次，得到单一菌落的内生菌平板；将分离纯化得到的内生菌接种至对应的斜面培养基中，待菌落完全长出后，保存于4℃冰箱；

(3)菌株筛选

初筛：将西洋参内生菌点在初筛平板上，28℃培养2-4天，选取产生透明圈的菌株用于复筛；所述初筛平板为脱脂奶粉50.0g/L溶于蒸馏水中，115℃灭菌15min；琼脂粉15.0g/L溶于蒸馏水中，121℃灭菌20min，冷却后混合均匀，取20mL倒入平板凝固而成；

复筛：将初筛选出的菌株用接种环挑取单菌落接种至装有50mL种子培养基的150mL三角瓶中，30℃、180r/min恒温震荡培养12h，制备种子液；取2％(v/v)种子液接种至装有50mL发酵培养基的150mL三角瓶中，30℃恒温震荡培养48h，发酵液在4℃、10000r/min条件下离心10min，取上清液备用；用直径3mm的打孔器打孔纤维蛋白平板，取10uL上清液注入孔中，以无菌生理盐水做对照，将纤维蛋白平板置于37℃恒温培养箱孵育18h后取出观察是否有透明圈产生，根据透明圈直径计算发酵液溶栓酶活力，筛选获得产溶栓酶的菌株。

3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilissp.)CG1在发酵制备溶菌酶中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的应用按如下步骤操作：

(1)斜面培养：将菌株CG1接种于牛肉膏蛋白胨(NA)培养基中，于37℃恒温培养24-48h，待菌落完全长出后，获得菌体斜面；

(2)种子培养：从步骤(1)菌体斜面上挑取菌体接种至种子培养基中恒温震荡培养12-18h，制得CG1种子液；

(3)发酵产酶：将步骤(2)获得的种子液接入发酵培养基中，于28-38℃，150-200r/min的条件下，震荡发酵培养32-42h，获得CG1溶栓酶粗酶液。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用按如下步骤操作：

(1)斜面培养：将菌株CG1接种于牛肉膏蛋白胨(NA)培养基中，于37℃恒温培养37h，待菌落完全长出后，获得菌体斜面；

(2)种子培养：从步骤(1)菌体斜面上挑取菌体接种至种子培养基中恒温震荡培养15h，制得CG1种子液；

(3)发酵产酶：将步骤(2)获得种子液接入发酵培养基中，于32℃，187r/min的条件下，震荡培养37h，获得CG1溶栓酶粗酶液。