[发明专利]一种具有免疫增强作用的硒化大蒜多糖及其制备方法

权利要求书

1.一种具有免疫增强作用的硒化大蒜多糖及其制备方法，其特征在于：所述制备方法包括如下步骤：

S1、将大蒜研磨碎并采用水提醇沉法提取大蒜粗多糖cGPS，冷冻干燥；

S2、用三氯乙酸法除去cGPS中的蛋白质，再经冷冻干燥，得纯化的大蒜多糖GPS；

S3、采用硝酸-亚硒酸钠法，分别以亚硒酸钠的用量、反应温度和反应时间三因素、三水平设计正交试验，以优化硒化修饰条件，得到9种硒化大蒜多糖sGPS₁~sGPS₉；

S4、将GPS、sGPS并溶于去离子水中，采用苯酚-硫酸法测定多糖的糖含量，并采用紫外线可见分光光度计测定；

S5、精密称取sGPS并用超纯水稀释，加高氯酸-硝酸混合酸，并放置于冰箱冷消化，得到溶液；

S6、将溶液置于通风厨内，进行加热与冷却，再用电感耦合等离子质谱仪测定溶液中硒的含量。

2.根据权利要求1所述的一种具有免疫增强作用的硒化大蒜多糖及其制备方法，其特征在于：所述步骤S1中包括：

①加无水乙醇浸泡12h后用索氏提取器回流脱脂2次，每次2h，纱布过滤取蒜末，65℃烘干后称重，加入7倍质量的水100℃浸提240min，再将浸提液浓缩至1/5体积，2500r/min离心10min，上清液缓慢加无水乙醇定容至80%，4℃冰箱静置过夜；

②弃上清取沉淀并用丙酮洗涤两次后，置通风橱内晾干，再用超纯水溶解，冷冻干燥，得大蒜粗多糖cGPS，称重，按下式公式计算得率：多糖得率（%）=多糖质量（g）/药材质量（g）×100%，同时测多糖含量。

3.根据权利要求1所述的一种具有免疫增强作用的硒化大蒜多糖及其制备方法，其特征在于：所述步骤S2包括：

①加去离子水溶解成0.1g/mL的溶液，于60℃水浴中使完全溶解，用10%NaoH调溶液pH至7.0，之后加3%三氯乙酸溶液使占总溶液体积的7.5%，4℃静置4h，3000r/min离心20min；

②取上清液缓加无水乙醇至终浓度为80%，静置过夜，取沉淀用丙酮洗两次，之后置于通风橱晾干，再用超纯水溶解，冷冻干燥得GPS，称重，计算多糖得率，测糖含量。

4.根据权利要求1所述的一种具有免疫增强作用的硒化大蒜多糖及其制备方法，其特征在于：所述步骤S3种包括：

①取三个水平，为A：以每500mgGPS加200mg、300mg、400mg；B：50℃、70℃、90℃；C：6h、8h、10h，按照正交表设计9种修饰条件；

②取GPS500mg9份，分别置于250mL三角瓶中，缓慢滴加0.5%HNO350mL，边加边搅拌使充分溶解，并搅拌均匀使充分接触，置于恒温水箱反应，反应结束后冷却至室温，用无水碳酸钠调节pH至5~6，3000r/min离心10min，上清液装入透析袋中流水透析,每隔6h取一次透析样液，用抗坏血酸法检测样液中是否含Na2SeO3，至无Na2SeO3残留时停止透析，透析袋内液体浓缩后冷冻干燥，得到9种sGPS，依次标记为sGPS1~sGPS9,称重，计算硒化多糖得率，并进行糖含量、硒含量测定。

5.根据权利要求1所述的一种具有免疫增强作用的硒化大蒜多糖及其制备方法，其特征在于：所述步骤S4中包括：

①精密吸取0.1mg/mL的葡萄糖对照品储备液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL各三份于试管中，加去离子水至2mL，摇匀，再加入5%苯酚溶液1mL后，接着迅速加入5mL浓硫酸，充分摇匀，静置至室温，用紫外可见分光光度计测定其490nm处的吸光度值，并绘制标准曲线，用于测定多糖的糖含量；

②精密称取GPS、sGPS各100mg并溶于去离子水中，稀释成0.2mg/mL的样品溶液，吸取0.4mL于三个试管中，并加去离子水至2mL，然后加5%苯酚溶液1mL，充分摇匀，随之迅速加5mL浓硫酸，摇匀，静置于常温水中以至室温，紫外可见分光光度计测定其490nm处的吸光度值（A），并将A代入以上回归方程，得多糖含量，多糖含量（%）=多糖质量（mg）/多糖样品质量（mg）×100%。