[发明专利]一种人泪腺干细胞及其分化培养方法与应用

权利要求书

1.一种泪腺干细胞的原代分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提供来源于正常人的泪腺组织样品；

(2)用95～100％(v/v)的乙醇清洗上述泪腺组织样品，用PBS缓冲液清洗，再去除残留脂肪；

(3)将泪腺组织样品用消化液消化；

(4)将消化后的组织离心去上清，将细胞沉淀重悬于胰酶-EDTA溶液中消化；

(5)加入含10～15％(v/v)FBS的DMEM培养基，离心去上清；

(6)再加入含10～15％(v/v)FBS的DMEM培养基，用40～70μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，离心去上清；

(7)重悬细胞沉淀于泪腺干细胞培养基中培养，得到所述人泪腺干细胞。

2.根据权利要求1所述的原代分离培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中消化液为含胶原酶和分散酶的DMEM培养基，以所述消化液的总体积计，所述胶原酶和分散酶的浓度分别为0.2～0.5mg/mL；优选地，所述步骤(3)消化液的用量为10～12倍于所述泪腺组织样品体积；优选地，所述步骤(3)消化的条件为37℃消化1～3小时。

3.根据权利要求1所述的原代分离培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述的消化为冰上消化1～3小时或37℃消化10～15分钟。

4.根据权利要求1所述的原代分离培养方法，其特征在于，所述步骤(7)中泪腺干细胞培养基为：DMEM培养基与F12培养基按体积比3：1混合，并添加5％L-谷氨酰胺，10％胎牛血清、0.1％氢化可的松，8.4ng/mL霍乱毒素(cholera toxin)，10ng/mL表皮生长因子(epithelial growth factor(EGF))，1/50B27，100U/mL青霉素(penicillin)，100μg/mL链霉素(streptomycin)，0.25μg/mL两性霉素B(Fungizone)，30μM法舒地尔(Fasudil)；

其中，所述步骤(7)中，培养的条件为37℃、5％CO₂。

5.权利要求1-4任一项所述的原代分离培养方法所得到的人泪腺干细胞。

6.根据权利要求5所述的人泪腺干细胞，其特征在于，所述人泪腺干细胞来源于人的正常泪腺干细胞，染色体为二倍体，STR(短串联重复序列)基因型以22个“STR基因座/等位基因长度”来表示，包括AMEL/X/X，D3S1358/15/16，D13S317/8/12，D7S820/11/12，D16S539/10/11，Penta D/9/12，D2S441/10/11，TPOX/11/12，TH01/7/7，D2S1338/17/17，CSF1PO/11/12，Penta E/14/14，D10S1248/15，D19S433/13/15.2，vWA/14/16，D21S11/29/33.2，D18S51/12/20，D6S1043/10/18，D8S1179/14/15，D5S818/11/11，D12S391/18/21，FGA/19/24。

7.一种人泪腺干细胞，其特征在于，所述人泪腺干细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202076。

8.如权利要求5-7任一项所述的人泪腺干细胞的传代培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将所述人泪腺干细胞增殖至70～90％丰度时，用PBS缓冲液洗涤细胞，再用胰酶-EDTA溶液消化单层细胞；

(2)加入DMEM培养基中和化反应；离心去上清，用泪腺干细胞培养基重悬细胞沉淀，进行培养。

9.如权利要求8所述的人泪腺干细胞的应用，其特征在于，包括将所述人泪腺干细胞经3D气液培养界面分化培养法进行分化培养，得到人泪腺腺泡器官模型。

10.权利要求8任一项人泪腺干细胞在制备治疗泪腺功能失调相关疾病的药物中的应用。