[发明专利]一种人泪腺干细胞及其分化培养方法与应用

说明书

本发明公开了一种人泪腺干细胞及其分化培养方法与应用。本发明的人泪腺干细胞的保藏编号为CCTCC NO：C202076；该细胞原代分离培养自人的正常泪腺组织，该细胞未导入任何外源基因，可用于人正常细胞的生理学研究，泪腺和泪腺相关疾病包括干眼症、泪液分泌的发病机理研究，环境污染物对泪腺的毒理学研究、药物的药理学研究等，也为人泪腺功能失调等相关疾病的细胞治疗提供了基础。

技术领域

本发明属于细胞工程领域，涉及一种人泪腺干细胞及其分化培养方法与应用。

背景技术

泪腺是眼部的重要器官，主要功能为分泌泪液，保持眼部湿润，功能失调会导致干眼症的发生。如果泪腺功能受损或者发生病变，通常会导致人的眼睛患干眼症等疾病。干眼症患者通常伴随角膜炎症，甚至引起角膜细胞受损、形成溃疡、导致患者视力下降，影响其生活质量。对于干眼症患者，目前药物治疗虽可以缓解症状，但尚不能从根本上解决泪腺功能失调的问题。泪腺如果获得能在体外稳定培养传代的人泪腺干细胞，并构建人工泪腺，将使利用患者自身泪腺细胞重建泪腺功能成为可能，对再生医学研究与应用有重大意义。

然而，现有的泪腺干细胞体外培养方法分效率低、数量少，难以持续传代培养，大大限制了其临床应用。因此，需要更加优良的分离方法和培养体系来分离和培养泪腺干细胞。

3D气液界面培养可以培养出类似于体内上皮组织的类器官。由于能在体外模型中培养类似于体内状态的活细胞，气液界面通常用于研究呼吸系统疾病、消化系统疾病方面的研究，包括细胞间的信号传递和疾病建模。但尚未见其用于泪腺干细胞培养的报道。

发明内容

本发明的首要目的在于针对现有技术的不足，提供一种人泪腺干细胞。该细胞分离培养自中国人的正常泪腺组织，该细胞未导入任何外源基因，可以无限增殖、并可以诱导呈现具有腺泡特征。

本发明的另一目的在于提供上述人泪腺干细胞的原代分离培养方法。

本发明的再一目的在于提供上述人泪腺干细胞的无限传代培养方法。

本发明的目的还在于提供上述人泪腺干细胞的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

首先，本发明提供一种泪腺干细胞的原代分离培养方法，包括如下步骤：

(1)提供来源于正常人的泪腺组织样品；

(2)用95～100％(v/v)的乙醇清洗所述泪腺组织样品，用PBS缓冲液清洗，再去除残留脂肪；

(3)将所述泪腺组织样品用消化液消化；

(4)将消化后的组织离心去上清，将细胞沉淀重悬于胰酶-EDTA中消化；

(5)加入含10～15％(v/v)FBS的DMEM培养基，离心去上清；

(6)再加入含10～15％(v/v)FBS的DMEM培养基，用40～70μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，离心去上清；

(7)重悬细胞沉淀于泪腺干细胞培养基中培养，得到所述人泪腺干细胞。

在一些实施例中，所述PBS缓冲液为0.01M，pH 7.4。

在一些实施例中，所述去除残留脂肪的步骤包括再将所述泪腺组织样品放入含预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，去除所述泪腺组织样品中残留的脂肪；在一些实施例中，所述的预冷为在冰上预冷。

在一些实施例中，步骤(3)中所述消化液为含胶原酶和分散酶的DMEM培养基；在一些实施例中，以所述消化液的总体积计，所述胶原酶和分散酶的浓度分别为0.2～0.5mg/mL。

在一些实施例中，步骤(3)中所述的消化液的用量优选为10～12倍于组织样品体积。