[发明专利]一种分离内耳FZD10阳性胶质细胞的方法有效
| 申请号： | 202110717916.9 | 申请日： | 2021-06-28 |
| 公开（公告）号： | CN113403277B | 公开（公告）日： | 2023-05-16 |
| 发明（设计）人： | 刘闻闻;王嫚;徐磊;王海波 | 申请（专利权）人： | 山东省第二人民医院（山东省耳鼻喉医院;山东省耳鼻喉研究所） |
| 主分类号： | C12N5/079 | 分类号： | C12N5/079 |
| 代理公司： | 济南舜源专利事务所有限公司 37205 | 代理人： | 苗峻 |
| 地址： | 250023 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 分离 内耳 fzd10 阳性 胶质 细胞 方法 | ||
1.一种分离内耳FZD10阳性胶质细胞的方法，其特征在于，具体步骤包括：
（1）取出生后第2至4天龄的FZD10-creER+/-/Rosa26R-tdTomato+/-双阳性乳鼠，解剖出耳蜗，去除蜗壳暴露耳蜗内部结构后，撕去外围的螺旋韧带并去除柯蒂氏器，将剩余蜗轴部分转移到含有预冷的Hanks液的离心管中，然后1000-1500rpm离心5-10分钟；
（2）步骤（1）离心结束后弃去上清Hanks液，加入酶解液，置于37℃细胞培养箱中消化7至15分钟，期间每隔两分钟轻弹离心管底部以使耳蜗组织与酶解液接触更加充分，加入等体积含10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化，1500rpm离心5分钟；
（3）步骤（2）离心结束后弃去上清，加入新鲜培养液，持离心管倾斜30度，采用微量移液器轻轻吹打并尽量避免引入气泡，吹打90-120下，至肉眼看不到成团组织；
（4）将细胞悬液过40μm细胞滤器去除少量未离散完全的细胞团，收集单细胞悬液并进行流式分选，分离得到FZD10阳性胶质细胞；
步骤（2）中所述的酶解液组成为：1mL 酶解液中包含10 Kunits的DNAse、1mg -5mg的胶原酶、余量的Hanks液。
2.根据权利要求1所述的一种分离内耳FZD10阳性胶质细胞的方法，其特征在于，步骤（1）中离心操作为：1500rpm离心5分钟。
3.根据权利要求1所述的一种分离内耳FZD10阳性胶质细胞的方法，其特征在于，步骤（2）中消化时间为10分钟。
4. 根据权利要求1所述的一种分离内耳FZD10阳性胶质细胞的方法，其特征在于，步骤（2）中所述的酶解液组成为：1mL 酶解液中包含10 Kunits的DNAse、4mg的胶原酶、余量的Hanks液。
5. 根据权利要求1所述的一种分离内耳FZD10阳性胶质细胞的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的新鲜培养液组成为：DMEM/F12培养基中加入N2：10 μL/mL、B27：0 μL/mL、氨苄青霉素：1 μL/mL，使用之前加入人碱性成纤维生长因子hBFGF：10 ng/mL、胰岛素样生长因子-1：50 ng /mL、上皮细胞生长因子EGF：20 ng /mL、硫酸乙酰肝素HS：50 ng /mL。
6. 根据权利要求1所述的一种分离内耳FZD10阳性胶质细胞的方法，其特征在于，具体的流式分选过程中使用70μm喷嘴，调整流速为5000 events/s，使用561nm的黄绿激光进行目标分选。
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