[发明专利]一种分离内耳FZD10阳性胶质细胞的方法

说明书

本发明涉及细胞分离和纯化领域，具体涉及一种分离内耳FZD10阳性胶质细胞的方法。本申请利用转基因鼠杂交使得内耳中的FZD10阳性胶质细胞获得荧光标记，从而便于后续通过流式分选获取纯化的内耳胶质细胞。本发明所采用的分离纯化技术能够最大限度的获取胶质细胞并保持细胞的活性，分选后FZD10阳性胶质细胞纯度达到98%以上，能够满足后续实验的需要，且分析纯化过程简洁快速，非常适用于后续实验研究。

技术领域

本发明涉及细胞分离和纯化领域，具体涉及一种分离内耳Frizzled10 （FZD10）阳性胶质细胞的方法。

背景技术

耳聋是全球性的重大公共卫生问题，全球大约有5亿人患有残疾性听力损失障碍，占世界总人口的6.5%，并存在上升趋势。其中感音神经性聋患者占比约65%。感音神经性耳聋是指发生病变的部位位于耳蜗及其之后的听觉通路，主要由耳蜗毛细胞和螺旋神经元蜕变造成。不同于外耳道或者中耳病变所引起的传导性聋，相当一部分感音神经性聋往往是永久性的且较难逆转。当前对于感音神经性聋的治疗主要采用人工耳蜗移植的方式。人工耳蜗通过直接对内耳中的神经元产生电刺激从而发挥治疗听力损失的作用，因此人工耳蜗的治疗效果很大程度上依赖于内耳中存活的螺旋神经元的数量和质量。近年来对于螺旋神经元的保护和再生的研究十分火热。

耳蜗中存在着一类在发育上与神经元有共同起源的胶质细胞，包括施旺细胞和卫星细胞两类，研究发现这类细胞具有自我增殖能力并且能够在体外培养和体内情况下转化为神经元。因此从内耳组织中获取纯化的耳蜗胶质细胞从而研究胶质细胞的增殖及向神经元的分化过程对于内耳再生研究具有重大意义。

然而由于耳蜗的解剖结构较为复杂以及研究技术的限制，当前仍然缺乏对于耳蜗胶质细胞的分离纯化的方法说明。胶质细胞分离纯化的第一步是耳蜗蜗轴的消化分离，在之前的大多数文献中，对于内耳中蜗轴的消化方法的介绍并不完善，例如对于消化用酶的种类，浓度，消化条件，细胞吹打方式等的描述不够详尽(Petitpre et al., 2018)。Sun etal.等人在对于蜗轴的消化过程中，采用两步消化法，每步消化时间长达30min，且所采用的的试剂种类较多，过程繁琐。

此外，在针对胶质细胞的纯化方面，之前的研究中只能分离全部的蜗轴细胞，并研究其向神经元的分化。然而蜗轴中的细胞包括神经元，胶质细胞，成纤维细胞等多种细胞类型，这使得对于胶质细胞增殖及分化特性的研究较为困难。有研究者利用神经元不能增殖传代的特性，通过先进行三代以上的成球培养以去除分离的蜗轴细胞中的神经元，然而由于一代成球就需要4到6天时间，这种方法较大的延长了实验时间，并一定程度上降低了胶质细胞的活性。此外由于内耳中的成纤维细胞同样具有增殖能力，因此这种方法并不能很好的去除蜗轴的成纤维细胞(McLean, McLean, Eatock,  Edge, 2016)。

因此当前急需一种简便而快速的分离纯化内耳胶质细胞的方法来满足对于内耳胶质细胞研究的需要。胶质细胞难以分离纯化主要是两方面原因，一是内耳解剖结构复杂：胶质细胞位于内耳的蜗轴内。内耳位于颞骨岩部，包括复杂而精密的双层迷路结构：外层骨迷路和内层膜迷路。耳蜗位于内耳迷路的前部，为两圈半的螺旋结构。骨性蜗轴位于耳蜗膜迷路正中央，呈圆锥形。蜗轴上环绕骨螺旋板，从蜗底向蜗顶呈螺旋状上升并延伸进入骨性蜗管。因此耳蜗蜗轴位置深入，骨质坚硬，其解剖有一定的技术难度。另一方面，在蜗轴中神经元、胶质细胞以及成纤维细胞等都是紧密伴生的，常规分离、消化蜗轴组织后得到的是以上多种细胞的混合物，不是只有胶质细胞。耳蜗中的胶质细胞包括施旺细胞和卫星细胞两种。众多的施旺细胞紧密贴附在神经元的突起上形成髓鞘结构，使得所有的神经纤维都被髓鞘包裹。而卫星细胞分布于神经元的胞体周围，包绕着神经元的胞体。因此，不可能直接分离耳蜗后得到纯的胶质细胞。

发明内容