[发明专利]一种水貂蛙抗菌肽的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

抗菌肽多聚体的设计：所述水貂蛙抗菌肽为[D4K]B2RP，所述[D4K]B2RP的序列为GIWKTIKSMGKVFAGKILQNL，并在该序列的3′端加入氨基酸形成[D4K]B2RPR，将[D4K]B2RPR与[D4K]B2RPR之间通过Gly和Arg连接，进行多次重复串联，形成抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM；

抗菌肽多聚体的融合表达：将所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM连接至PGEX-4T-2载体上，并与PGEX-4T-2载体自带的融合蛋白GST标签进行融合表达出抗菌肽多聚体融合蛋白，且所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM与融合蛋白GST标签之间通过Gly和Arg进行连接；

水解与去除标签：将所述抗菌肽多聚体融合蛋白通过凝血酶进行水解，上GST标签亲和层析柱，去除GST标签，得到抗菌肽单体[D4K]B2RPR。

2.根据权利要求1的一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：所述[D4K]B2RPR进行四次重复串联，形成所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM的氨基酸序列为GIWKTIKSMGKVFAGKILQNLRGIWKTIKSMGKVFAGKILQNLRGIWKTIKSMGKVFAGKILQNLRGIWKTIKSMGKVFAGKILQNLR。

3.根据权利要求2的一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：还包括步骤：偏好密码子优化：将设计好的所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM的氨基酸序列基于大肠杆菌进行偏好密码子优化，并进行核苷酸序列合成，并在所述核苷酸序列两端引入BamHI和EcoRI位点。

4.根据权利要求3的一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM的氨基酸序列基于大肠杆菌进行偏好密码子优化得到核苷酸序列如SEQ1。

5.根据权利要求4的一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：还包括步骤：通过双酶切和PCR进行重组子验证：在所述核苷酸序列两端引入BamHI和EcoRI位点，并设计一对引物进行重组子鉴定，其中上游引物位于抗菌肽多聚体上，下游引物位于PGEX-4T-2载体上；然后将含抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM基因序列的载体和PGEX-4T-2载体均用BamHI和EcoRI双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定。

6.根据权利要求5的一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：所述引物扩增片段大小为368bp，且引物核苷酸序列分别如下：

F：5'——ATCAAAAGCATGGGCAAGGTT——3'；

R：5'——CCACCTGACGTCTAAGAAACCATT——3'；

所述重组子以F、R为引物进行PCR反应,PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察。

7.根据权利要求3的一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：所述抗菌肽多聚体的融合表达步骤中，利用PGEX-4T-2载体上的酶切位点BamHI和EcoRI将所述核苷酸序列插入到PGEX-4T-2载体，并导入大肠杆菌BL21中。

8.根据权利要求7的一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：将含有所述核苷酸序列的大肠杆菌BL21，转入2*YT培养基中进行发酵培养，并待OD600数值接近1.5的时候加入IPTG，进行诱导培养6个小时。

9.根据权利要求8的一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：所述水解与去除标签步骤中，将诱导培养6个小时后的产物通过GST标签亲和层析，获得纯化后的抗菌肽多聚体融合蛋白。

10.将权利要求1-9中任一项所述的一种水貂蛙抗菌肽的制备方法制备得到的抗菌肽[D4K]B2RPR应用于抗生素的替代药物。