[发明专利]一种水貂蛙抗菌肽的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种水貂蛙抗菌肽的制备方法及其应用，属于生物工程技术领域，包括以下步骤：所述水貂蛙抗菌肽为[D4K]B2RP，所述[D4K]B2RP的序列为GIWKTIKSMGKVFAGKILQNL，并在该序列的3′端加入氨基酸形成[D4K]B2RPR，将[D4K]B2RPR与[D4K]B2RPR之间通过Gly和Arg连接，进行多次重复串联，形成抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM；将所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM连接至PGEX‑4T‑2载体上，并与PGEX‑4T‑2载体自带的融合蛋白GST标签进行融合表达出抗菌肽多聚体融合蛋白；上GST标签亲和层析柱，去除GST标签，得到抗菌肽单体[D4K]B2RPR。通过该制备方法能够大大提高抗菌肽的产量，且制备相对精简，有利于降低生产成本。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体属于一种水貂蛙抗菌肽的制备方法及其应用。

背景技术

从1928年英国科学家弗莱明发现了青霉素开始，抗生素在对抗病魔的应用上已经八十多年之久，然而毫无节制的使用抗生素使得目前抗生素的药效减弱，而细菌的耐药性增强。在中国每年生产抗生素原料大约21万吨，除去原料出口大概3万吨之外，其与的18万吨在国内使用，包括在医疗与农业等领域的使用，中国研制一个抗生素大约需要十年时间，而产生耐药菌素却在两年之内。然而现在抗生素的开发正变得越来越难，而多种类抗生素的全民式滥用，催生病菌的强耐药能力，这使得医生也对它们几乎束手无策。

目前，抗生素的滥用问题及其严重，抗生素的残留以及微生物产生耐药性的问题很是突出，细菌性的疾病感染问题再次威胁到人类的生命健康。而随着细菌抗药性继续增强，新的“超级细菌”还会陆续出现，如果不对抗生素使用加以有效控制的话，很有可能真的出现无药可用的局面。

抗菌肽作为短肽，具有易被降解，而且不易产生耐受性，抗菌效果良好等特点，有望成为替代抗生素的新型替代物而被广泛研究。目前，抗菌肽的制备主要有从动植物原料提取、化学合成及基因工程表达三种生产手段。然而，由于动植物原料提取以及化学合成的生产制备产量低，成本较高，很难进行大规模生产，尚未实现其产业化。再者也不能一味追求抗菌效果，还需要考虑抗菌肽的溶血率，因此，到目前为止，很难找到真正适合、具有良好应用前景的抗菌肽。

发明内容

针对背景技术中存在的缺陷和不足，本发明提供了一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，通过该制备方法能够大大提高抗菌肽的产量，且制备相对精简，有利于降低生产成本。

本发明的目的之二是将上述一种水貂蛙抗菌肽的制备方法制备得到的抗菌肽[D4K]B2RPR应用于抗生素的替代药物中，从而有利于减少抗生素的使用，且对环境更友好。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：

抗菌肽多聚体的设计：所述水貂蛙抗菌肽为[D4K]B2RP，所述[D4K]B2RP的序列为GIWKTIKSMGKVFAGKILQNL，并在该序列的3′端加入氨基酸形成[D4K]B2RPR，将[D4K]B2RPR与[D4K]B2RPR之间通过Gly和Arg连接，进行多次重复串联，形成抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM；

抗菌肽多聚体的融合表达：将所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM连接至PGEX-4T-2载体上，并与PGEX-4T-2载体自带的融合蛋白GST标签进行融合表达出抗菌肽多聚体融合蛋白，且所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM与融合蛋白GST标签之间通过Gly和Arg进行连接；

水解与去除标签：将所述抗菌肽多聚体融合蛋白通过凝血酶进行水解，上GST标签亲和层析柱，去除GST标签，得到抗菌肽单体[D4K]B2RPR。