[发明专利]分子标签接头及测序文库的构建方法

说明书

本发明公开了分子标签接头和测序文库的构建方法。该分子标签接头包括第一接头和第二接头，第一接头包括：第一链，第一链包括从5′端依次的第一固定碱基序列、随机碱基序列和第一引物结合序列；第二链，第二链包括从5′端依次的第二固定碱基序列和碱基T；其中，第一链和第二链通过第一固定碱基序列和第二固定碱基序列的反向互补配对而结合；第二接头包括第二引物结合序列，第二引物结合序列与第一引物结合序列至少部分反向互补。采用该分子标签接头进行文库构建时，测序数据中没有互补链的聚簇的占比显著降低，有效聚簇的数量得到提高，达到了提高测序数据利用率、降低测序成本、提高检测灵敏度和测序深度的效果。

技术领域

本申请涉及测序技术领域，尤其是涉及分子标签接头及测序文库的构建方法。

背景技术

循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)是指坏死或凋亡的肿瘤细胞释放到外周血中的肿瘤DNA片段。由于ctDNA包含了肿瘤特异性的表观遗传信息，利用ctDNA来实时检测肿瘤状态以避免穿刺手术给患者带来的痛苦也就成为了一种可行的非侵入式检测方法。但是，肿瘤的异质性使得外周血中ctDNA的含量极少，其突变频率一般也在1％以下，属于低频突变。因此，ctDNA液体活检虽然是目前精准肿瘤学应用中的热点，但如何准确检测仍然是亟待解决的问题。

下一代基因测序技术(NGS)是目前应用最广的测序技术，具有测序深度高、通量大、准确率高、灵敏度好等优势，然而NGS应用于ctDNA低频突变检测同样存在一定的技术难点。一方面，NGS不可避免地存在测序误差，单碱基错误率一般在0.1～1％之间；而另一方面，测序文库构建一般使用高保真酶进行PCR扩增，也存在10^-6左右的复制错误率，并且随着PCR循环数增多而增大。这两方面的因素导致ctDNA低频突变测序分析时存在较大的背景噪音，特别是在0.1％及以下检测限的情况下，难以区分建库及测序过程中引入的错误与ctDNA本身的突变，容易出现假阳性结果。

目前，主要通过建库连接步骤，采用带有分子标签的接头，将待测核酸分子标记一个唯一可识别的序列编码，通过该唯一序列编码来区分真正的突变与建库及测序过程中引入的错误，实现低频突变的检测。带有分子标签的接头主要包括两类：一类是接头双链的随机碱基区域(用作分子标签)互补配对的，一类是接头双链的随机碱基区域不互补配对的。采用随机碱基区域互补配对的接头标记得到的最终测序数据，需要根据分子标签和起始位置进行互补双链的链间校正，随机碱基区域不互补配对的接头，同一模板DNA两条双链之间的分子标签没有对应关系，无法进行互补双链链间校正，而随机碱基区域互补配对的接头，可以进行链间校正。链间校正可以在链内校正的基础上进一步去除建库及测序过程引入的错误，识别原始模板携带极低频突变，提高ctDNA检测灵敏度。因而，选择能够进行链间校正的接头是提高检测准确性的有效方式。

链间校正时，需要来自同一原始DNA分子的两个聚簇同时存在，要求报证DNA双链同时被加上完整接头。然而现有的分子标签引入方法是在加接头时，直接连接上双链接头。因此，大量模板存在其中一条链连上完整接头、而另一条链没有完整接头的情况，这导致最终的测序数据中存在大量没有互补链聚簇的数据，占用了测序数据，影响了测序深度。

发明内容

本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种有效提高测序深度的分子标签接头。

本申请的第一方面，提供分子标签接头，该分子标签接头包括第一接头和第二接头，第一接头包括：

第一链，第一链包括从5′端依次的第一固定碱基序列、随机碱基序列和第一引物结合序列；

第二链，第二链包括从5′端依次的第二固定碱基序列和碱基T；

其中，第一链和第二链通过第一固定碱基序列和第二固定碱基序列的反向互补配对而结合；

第二接头包括第二引物结合序列，第二引物结合序列与第一引物结合序列至少部分反向互补。