[发明专利]一种L-赖氨酸脱羧酶SpLDC及其在产1，5-戊二胺上的应用

说明书

本发明公开了一种L‑赖氨酸脱羧酶SpLDC及其在产1，5‑戊二胺上的应用。L‑赖氨酸脱羧酶SpLDC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且该L‑赖氨酸脱羧酶能够在宿主中能够良好的表达，具有高催化L‑赖氨酸合成戊二胺的活性，且pH稳定性和温度稳定性良好，经测试可知，在pH5‑8时催化能力强，其中pH6.5时催化能力最优，且在pH8条件下放置12h，酶的合成戊二胺的能力依然能保持80%以上，具有良好的pH稳定性；在30‑52℃之间具有较高的催化活性，52℃下酶的最适催化能力最优；在52℃孵育12h酶催化活性依然保持在80%以上，具有良好的温度稳定性。

技术领域

本发明涉及1,5-戊二胺的制备技术领域，具体涉及来一种L-赖氨酸脱羧酶SpLDC及其在产1，5-戊二胺上的应用。

背景技术

1,5-戊二胺（又名尸胺；1,5-二氨基戊烷；五亚甲基二胺；尸毒素），其广泛存在于原核生物及真核生物中，具有多种生物活性，尤其在植物和微生物的生理活动具有重要的调控作用。在生物体内戊二胺的产生主要是以赖氨酸为前体，在赖氨酸脱羧酶的脱羧作用下生成，在过程中会释放二氧化碳。

目前，戊二胺作为产品在农业，医学，化工，等领域得到广泛的应用，并且以其为原料生产的产品已经应用到我们生活的方方面面。在农业上，1,5-戊二胺可用于调控植物衰老过程、促进花蕊的发育、改善植物果实、提高果实产量。在医学上，戊二胺可以作为一种有效治疗痢疾的药物，并且其环化形成的化合物可以作为一种医药中间体合成多种药物；另外最新报道，戊二胺对肿瘤有一定抑制作用。在工业上，1,5-戊二胺是一种重要的化工原料。1，5-戊二胺与二元酸进行聚合反应合成特别的高分子材料聚酰胺，又称尼龙；其还可以聚合形成聚氨酯材料及合成异氰酸酯应用于涂料行业。目前尼龙材料多种多样，以己二酸和己二胺聚合而成的尼龙6,6，生产量为最大。而1,6-己二胺主要来源于不可再生资源石油。奇数碳的二元胺戊二胺和己二酸聚合而成尼龙56相对于尼龙66具有更好的物理性能。随着生物技术的发展，1，5-戊二胺可以以可再生资源生物质为原料进行生产。

1，5-戊二胺生产方法主要有微生物发酵法和全细胞催化法。微生物发酵法是以高产赖氨酸的大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌为菌种利用基因工程技术在细胞内表达赖氨酸脱羧酶基因直接合成戊二胺，并对戊二胺分解途径进行敲除；强化代谢上游基因来使得转化率最大化。原料多种多样，例如：葡萄糖，木糖，纤维素，半纤维素，甲醇等生物质资源。目前还在进行多种废弃生物质资源研究使得利益最大化，环境污染最小化。L-赖氨酸产能过剩促使全细胞催化法应用而生；这种方法是以L-赖氨酸盐酸盐为原料，以过表达赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌作为催化剂催化脱羧生产戊二胺。这种方法相对发酵法工艺更为简单，调控步骤少。而且1，5-戊二胺的生产浓度更高，更有利于戊二胺下游的分离。

L-赖氨酸脱羧酶是一种5-磷酸吡哆醛（plp）依赖性酶，大多数生物体内都含有该酶基因序列。在部分微生物体内，该酶还分为组成型和诱导性两种。目前，已经过表达于并且应用于戊二胺生产的赖氨酸脱羧酶有多种微生物来源，例如大肠杆菌(E.coli)、蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)、反刍动物月形单胞菌(Selenomonasruminantium)、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌等。在目前研究的赖氨酸脱羧酶中，大肠杆菌赖氨酸脱羧酶Cada和LdcC最为广泛，但是，大肠杆菌赖氨酸脱羧酶Cada在催化合成戊二胺过程中pH升到7.5时，酶活急剧下降，在催化过程中不稳定。大肠杆菌LdcC虽然最适催化pH在7.5，但是酶活较差；不适合工业化生产催化合成戊二胺。当然，目前有学者在基因文库中挖掘出相对活性较高的耐碱性pH较好的赖氨酸脱羧酶，物种的多样性是基因的多样性所决定。丰富的微生物资源使我们能够获得更为不同的赖氨酸脱羧酶，来满足目前生产中所遇到的困难。

发明内容