[发明专利]一种提高荧光艾美耳球虫卵囊分选成功率的方法和应用

说明书

本发明属于球虫技术领域，公开了一种提高荧光艾美耳球虫卵囊分选成功率的方法和应用，该方法包括以下步骤：将含有转基因艾美耳球虫卵囊的粪便进行球虫分离，得到球虫卵囊液A；将球虫卵囊液A进行孢子化，计数，稀释，得到卵囊液B；将卵囊液B静置，加入饱和食盐水，吹打，静置，取漂浮的卵囊加入水，离心后取沉淀，稀释，再进行单卵囊分离，得到目标卵囊；将目标卵囊经口感染SPF鸡进行传代，即得。本发明通过对含有转基因艾美耳球虫卵囊进行球虫分离，再进行孢子化，加入饱和食盐水，吹打后卵囊浮起，静置后收集卵囊，再通过单卵囊分离技术，经口感染SPF鸡进行传代，传代后的卵囊含荧光率增加到50％。

技术领域

本发明属于球虫技术领域，具体涉及一种提高荧光艾美耳球虫卵囊分选成功率的方法。

背景技术

鸡艾美耳球虫病防控正从传统的化学药物防治逐渐转变为疫苗防治，球虫疫苗免疫作为可替代药物防控的方法有广阔的应用前景。目前转基因技术在鸡艾美耳球虫疫苗的研发中开始广泛应用，为了开发绿色、安全、无污染的球虫疫苗，通常仅选用荧光蛋白作为标签筛选目标卵囊。且由于艾美耳球虫卵囊产量较大，而目标卵囊在初代卵囊中比例较低(约0.2％)，不适合直接用于流式细胞进行高效分选获得单一目标卵囊，常规的倍比稀释法在此处的应用效率较低，因此寻求一种提高荧光艾美耳球虫卵囊分选成功率的方法成为转基因球虫疫苗研发中急需解决的问题。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种提高荧光艾美耳球虫卵囊分选成功率的方法，在该方法中，通过对含有转基因艾美耳球虫初代卵囊进行球虫分离，再进行孢子化，加入饱和食盐水，吹打，静置，得到含有荧光的卵囊，再通过单卵囊分离，经口感染SPF鸡进行传代，得到高荧光率卵囊。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种提高荧光艾美耳球虫卵囊分选成功率的方法，包括以下步骤：

(1)将含有转基因艾美耳球虫卵囊的粪便进行球虫分离，得到球虫卵囊液A；

(2)将所述球虫卵囊A进行孢子化，计数，稀释，得到卵囊液B；

(3)将所述卵囊液B静置，置于显微镜下观察，记录含有荧光卵囊的编号及数量，加入饱和食盐水，吹打，静置，得到含有荧光的卵囊；

(4)向所述含有荧光的卵囊中加入水，离心后取沉淀，再进行单卵囊分离，得到目标卵囊；

(5)将所述目标卵囊经口感染SPF鸡进行传代，下一代即得含有转基因艾美耳球虫卵囊。

优选地，步骤(1)中，所述含有转基因艾美耳球虫卵囊的粪便为含有转基因艾美耳球虫初代卵囊的粪便，含有初代目标卵囊阳性率为0.2％。

优选地，步骤(1)中，所述球虫分离的具体步骤为：S1、将含有转基因艾美耳球虫卵囊的粪便揉碎，加入清水混匀，过滤，得到滤液；S2、向所述滤液中加入清水洗涤，离心，去除上清液，得到沉淀；S3、将所述沉淀加入饱和食盐水或饱和硫酸镁溶液中混匀，离心，收集上清液；S4、将所述上清液加入水稀释，离心，收集沉淀，即得所述球虫卵囊液A。

进一步优选地，步骤S2-S3中所述离心的转速为2200～3000r/m，离心的时间为2-5min。

优选地，步骤(2)中，所述孢子化的的具体步骤为：将球虫卵囊A转移至装有卵囊培养液的烧杯中，孵育20～24h孢子化，得到孢子化卵囊液。

进一步优选地，所述培养液为重铬酸钾溶液或氯氨T溶液。

更优选地，所述重铬酸钾溶液的质量分数为0.5～3％，所述氯氨T溶液的质量分数为0.5～3％。

进一步优选地，所述孵育的温度为25～30℃。

优选地，步骤(3)中，还包括将卵囊液B重复步骤(3)8-12次。