[发明专利]特异性识别猪COL1A1基因的gRNA及其生物材料、试剂盒和应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体而言，提供了一种特异性识别猪COL1A1基因的gRNA及其生物材料、试剂盒和应用。特异性识别猪COL1A1基因的gRNA中负责识别靶片段区域的核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示序列，本发明提供的gRNA能够识别猪COL1A1基因编码区下游如SEQ ID NO.5所示的靶序列。通过所述gRNA的介导，能够使Cas9靶向猪基因组上COL1A1基因的第51个外显子末端产生双链断裂，切割效率可达22％，进而实现对COL1A1基因进行编辑，如氨基酸的修饰、替换，或者在该位点插入外源基因表达框，实现外源基因的稳定、高效表达。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种特异性识别猪COL1A1基因的gRNA及其生物材料、试剂盒和应用。

背景技术

COL1A1基因编码I型胶原蛋白a1链，位于猪的12号染色体上，基因全长18094bp。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，是人体内最丰富的蛋白质，维持着组织和器官的完整结构，并与人体早期发育、器官形成、细胞间的连接、细胞趋化、血小板凝集以及膜的通透性等功能密切相关。胶原蛋白家族包括19种胶原蛋白及10种以上胶原样蛋白，由至少30种不同的基因编码。其中I型胶原在人体胶原中含量最丰富，I胶原蛋白一开始是由两个α1链-COL1A1基因编码，和一个前α2链-由COL1A2基因编码组成。I型胶原是动物身体中最丰富且表达最广泛的蛋白质。它是皮肤、骨、肌腱、韧带、血管、牙质和许多间质组织的主要组成成分。因此将外源基因定点整合到COL1A1基因第51个外显子的末端，不仅有助于深入研究COL1A1基因功能和蛋白定位，还可以在该位点形成一个友好基因座，极大的方便外源基因在多个组织的高效、稳定表达。因此，对猪COL1A1基因的高效编辑对进一步研究猪COL1A1基因，以及实现外源基因的稳定、高效表达具有重要意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种特异性识别猪COL1A1基因的gRNA。

本发明的第二目的在于提供与gRNA相关的生物材料。

本发明的第三目的在于提供一种试剂盒。

本发明的第四目的在于提供对猪基因组中COL1A1基因进行基因编辑的方法。

本发明的第五目的在于提供gRNA、生物材料、试剂盒或方法在定点整合外源基因中的应用。

本发明的第六目的在于提供一种在猪基因组中定点整合外源基因的方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种特异性识别猪COL1A1基因的gRNA，所述gRNA中负责识别靶片段区域的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列。

与上述gRNA相关的生物材料，包括：

(a)编码权利要求1所述的gRNA的DNA分子；

(b)表达盒，包括(a)中的DNA分子；

(c)表达载体，包括(a)中的DNA分子或(b)中的表达盒。

进一步地，所述(a)中的DNA分子序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述(b)中的表达盒还包括编码Cas9的DNA分子。

试剂盒，包括上述的gRNA或生物材料。

对猪基因组中COL1A1基因进行基因编辑的方法，在猪源生物材料中，利用上述的gRNA介导Cas9对猪COL1A1基因进行基因编辑。

进一步地，所述方法包括将基因编辑元件导入猪源生物材料中，所述基因编辑元件包括如下(a)或(b)：