[发明专利]基于CRISPR-Cas12a的SARS-CoV-2中D614G突变鉴定方法

权利要求书

1.一种用于CRISPR-Cas12a技术检测SARS-CoV-2中D614G突变的crRNA分子，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。

2.一种应用权利要求1所述crRNA分子基于非诊断目的的CRISPR-Cas12a技术检测SARS-CoV-2中D614G突变的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备样本核酸模板；

(2)使步骤(1)获取的核酸模板，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及所述crRNA分子在CRISPR-Cas12a技术检测体系里反应；

(3)对步骤(2)的反应体系进行荧光强度的检测。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的样本核酸模板由重组酶聚合酶核酸扩增方法制备。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物选自含有SEQ ID NO.7-11任一所示序列的核苷酸，所述重组酶聚合酶核酸扩增的下游引物选自含有SEQ ID NO.12-15任一所示序列的核苷酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.3所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物的序列由SEQ ID NO.11所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的下游引物的序列由SEQ ID NO.12所示。

6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述单链DNA探针的序列如SEQ ID NO.5所示。

7.一种CRISPR-Cas12a技术检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的crRNA分子，Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针，以及用于重组酶聚合酶核酸扩增的含有SEQ ID NO.7-11任一所示序列的上游引物，用于重组酶聚合酶核酸扩增的含有SEQ ID NO.12-15任一所示序列的下游引物。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述crRNA分子的序列如SEQ ID NO.3所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的上游引物的序列由SEQ ID NO.11所示，所述重组酶聚合酶核酸扩增的下游引物的序列由SEQ ID NO.12所示。

9.根据权利要求7或8任一所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA探针的序列如SEQ IDNO.5所示。

10.一种用于制备权利要求1所述crRNA的上游DNA单链和下游DNA单链，其特征在于，所述上游DNA单链的序列如SEQ ID NO.6所示，所述下游DNA单链的序列如SEQ ID NO.2或4所示。

11.一种用于制备权利要求1所述crRNA的方法，其特征在于，先使序列如SEQ ID NO.6所示的上游DNA单链和序列如SEQ ID NO.2或4所示的下游DNA单链进行杂交制备DNA体外转录模板，再根据所述DNA体外转录模板转录制备所述crRNA。

12.一种用于评价权利要求7所述试剂盒灵敏度和/或特异性的质粒，其特征在于，所述质粒是在序列如SEQ ID NO.18所示的pUC57质粒的第402bp至424bp区间插入序列如SEQ IDNO.16或SEQ ID NO.17所示的核酸构建而成。