[发明专利]基于CRISPR-Cas12a的SARS-CoV-2中D614G突变鉴定方法

说明书

本发明提供了一种crRNA分子及用于CRISPR‑Cas12a检测SARS‑CoV‑2中D614G突变的方法。本发明提供的crRNA用于CRISPR‑Cas12a技术检测SARS‑CoV‑2中D614G突变的方法简便、易行、快速、特异，当结合重组酶聚合酶核酸扩增技术时，灵敏度为10⁰拷贝/μL，具有极高的灵敏度，相比常用的基因测序方法，能够对病毒含量更低的样本进行鉴定，适合用于大规模筛查。

技术领域

本发明涉及一种基因突变的检测方法，属于基因检测应用领域。

背景技术

新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2，SARS-CoV-2)是单股正链RNA病毒，其功能性编码基因包括开放阅读框1ab基因(Open ReadingFrame 1ab，ORF1ab)、刺突蛋白基因(Spike protein，S)、包膜蛋白基因(Envelopeprotein，E)、膜蛋白基因(Membrane，M)和核蛋白基因(Nucleocapsid，N)。感染人体后可造成新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，患者出现发热、咳嗽、胸闷、乏力等流感样症状，严重者可出现呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征甚至死亡。新型冠状肺炎的传染源为新冠病毒感染者，通过呼吸道飞沫，直接接触新冠病毒污染物，粪口途径等多种途径在人群中迅速传播，所有人群均易感。

随着新型冠状病毒疫情的发展扩大，新型冠状病毒出现了非常多的基因位点突变，这些突变株可能增加了新型冠状病毒的传播能力、影响现有治疗的效果、增加感染者死亡风险或影响疫苗的效果等，为疫情的防控又发出了新的挑战。其中，D614G突变毒株引起了极大的关注，由于新冠病毒基因序列中第23403位核苷酸由腺嘌呤A突变成鸟嘌呤G，刺突蛋白上发生了一种非同义突变，第614位的氨基酸由天冬氨酸(D)突变为甘氨酸(G)引起。该突变株已成为新型冠状病毒的全球主要流行株，传播速度极快。新冠病毒通过刺突蛋白上的受体结合域与血管紧张素转化酶2(Angiotensin-Converting Enzyme 2，ACE2)结合后感染人体，D614G突变株中刺突蛋白上的受体结合构象发生改变，更容易与ACE2结合和融合，传染性更高。与此同时，D614G突变株在上呼吸道的复制增强，传染增强，且在年轻病人上呼吸道中的病毒载量更高。该突变株的出现和传播对新冠疫情的防控发出了新的挑战，疫情发生时迅速甄别D614G突变毒株至关重要。新型冠状病毒D614G突变位点鉴定的主要方法有DNA测序、突变扩增阻滞系统(Amplification Refractory Mutation System，ARMS)-PCR等，操作复杂、难度大、耗时长、成本高，开发一种快速鉴定D614G突变位点的检测方法非常必要。