[发明专利]一种腺苷参与的NMN半合成方法

说明书

本发明提供一种腺苷参与的NMN半合成方法，所述腺苷参与的NMN半合成方法包括同一反应体系下的步骤：(A)腺苷、磷酸盐以及可被酵母细胞代谢的糖类在酵母细胞的催化作用下反应生成ATP的步骤；(B)NR的酶促磷酸化步骤，对应NR和ATP在NRK的催化作用下反应生成NMN和ADP的步骤；如此以在ATP的生成与循环利用的过程中实现NMN的高效合成，在简化工艺的同时降低了排放。

技术领域

本发明涉及β-烟酰胺单核苷酸（NMN）合成技术领域，特别涉及一种腺苷参与的NMN半合成方法。

背景技术

β-烟酰胺单核苷酸（NMN）是肌体合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的直接前体，补充NMN是提升肌体NAD的含量水平的最有效途径，这对于促进肌体正常的新陈代谢具有广泛而深远的健康意义。因为长者NAD水平减少，而从食物中不能获得足够的NMN，故而NMN有望成为大规模应用的膳食补充剂。

目前，NMN的现有合成技术有发酵法、化学合成法、半合成法及全酶法四种方法。其中发酵法需要构建产生NMN微生物菌种，在此微生物大量培养繁殖的过程中，由菌体细胞合成NMN。由于各个物种包括低等的单细胞生物体内催化合成NMN的关键酶（NAMPT，烟酰胺磷酸核糖转移酶）的基础活性都普遍很低，使构建高效表达NMN的菌种异常困难，又因为NMN的合成路线长，涉及多酶体系及天然的分解酶系统，所以高效大规模的发酵法生产NMN的生产方法十分困难，工艺成本高，产品没有市场竞争力。化学合成法是以烟酰胺（或烟酸）、四乙酰核糖、三苯氧磷等基础原料，用化学方法先合成烟酰胺核糖（NR），再进一步将NR磷酸化得到NMN。该方法的主要问题在于第二步的化学磷酸化步骤涉及易燃易爆及剧毒，大规模产业化面临严重的环保与安监问题，也存在化学对映体杂质及毒性原料及溶剂残留等问题，其产品长期人体应用的安全性疑虑是面对消费者难以消除的问题。半合成法是在化学合成NR的基础上用酶法使NR磷酸化而得到NMN，该方法兼具化学法及酶法的优缺点，其主要问题是既有化学法的溶剂及毒性成分残留风险，酶法磷酸化步骤也需要昂贵的三磷酸腺苷（ATP），成本较高。全酶法是用烟酰胺、核糖及ATP（腺嘌呤核苷三磷酸）等为基础原料，用一系列酶的连环催化形成NMN。该方法优势在环保与安全，难点在于涉及多种酶的表达、纯化与固定化，现有技术存在规模化生产困难，酶的成本太高。

现有四种NMN的合成方法中，半合成法是当前合成NMN的主流方法。该方法的起始原料可以是烟酰胺（或烟酸）及四乙酰核糖，先用化学方法合成成NR，再用NR与ATP在特定激酶的催化下生成NMN，或直接以NR为原料做酶促反应生产NMN。半合成法的核心步骤是NR的酶促磷酸化，由ATP提供磷酸基给NR形成NMN，而ATP则变成了二磷酸腺苷（ADP），反应式为：NR + ATP → NMN + ADP，催化这一反应的酶为烟酰胺核糖激酶（NRK）。为了减少ATP的用量，通常将ADP与多磷酸盐（焦磷酸钠、三聚磷酸钠或六片磷酸钠等）再做酶促反应转化成ATP，实现ATP的重复利用，反应式为：ADP + PPi （焦磷酸）→ ATP + Pi（磷酸盐），催化这一反应的酶为腺苷酸磷酸转移酶（PPK2）。这两步酶促反应（NR的磷酸化及ATP的再生）可以分开做也可以合在一起反应。其工艺难点主要有二，一是反应累积大量的磷酸盐会干扰进一步反应 ，磷酸盐的分离去除工艺难度大，也影响ATP的回收率；二是反应系统涉及两个酶，酶的用量大成本高，同时不可避免地带来的杂酶也多，NR、NMN、ATP、ADP等的分解副反应程度也高，反应体系内会存在因副反应而产生的烟酰胺、核糖、ADP、AMP、NR、腺苷、腺嘌呤及磷酸盐等，因而体系成分变得复杂而不易控制，致使NMN产品的纯化过程困难而成本高企，产品质量的稳定性也难以控制。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种腺苷参与的NMN半合成方法，其中所述腺苷参与的NMN半合成方法相对于现有的半合成法能够简化NMN产品的纯化工艺而具有较低的成本。

本发明的一个目的在于提供一种腺苷参与的NMN半合成方法，其中所述腺苷参与的NMN半合成方法兼顾化学法和酶法的优点，在保障NMN产品的合成效率的同时能够降低排放，对应具有较低的生产成本和环境成本。