[发明专利]一种可以快速检测鸡球虫耐药性的分子标记、检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种可以快速检测球虫耐药性的分子标记，所述分子标记为柔嫩艾美耳球虫烯醇酶2（EtENO2）、磷酸甘油酸激酶（EtPGK）、醛酮还原酶家族的氧化还原酶（EtAKRO）。

2.如权利要求1所述的分子标记，其中，所述柔嫩艾美耳球虫烯醇酶2（EtENO2）的序列如SEQ ID NO.15所示；所述磷酸甘油酸激酶（EtPGK）的序列如SEQ ID NO.16所示；所述醛酮还原酶家族的氧化还原酶（EtAKRO）的序列如SEQ ID NO.17所示。

3.一种快速检测球虫耐药性分子标记的应用，所述应用为利用相对荧光定量PCR来测定鸡球虫对抗球虫药地克珠利、马杜拉霉素的耐药性，所述方法为：

模板的制备：

1）总RNA的提取；提取柔嫩艾美耳球虫敏感株、实验室诱导的地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株和田间分离株的虫体RNA，随后进行凝胶电泳实验检测RNA的完整性，并利用Nano Drop™测定RNA的浓度与质量；

2）去除基因组DNA；按照下表中的体系向无RNAase离心管中依次加入各试剂，充分混匀后将其放入37℃的水浴锅中孵育30~35min，之后再置于冰上静置3min；

3）RNA的纯化；使用RNeasy Mini Kit试剂盒对提取后的RNA进行纯化（具体步骤见说明书）；之后按照说明书对RNA进行反转录，以此获得柔嫩艾美耳球虫不同虫株的cDNA；

4）cDNA的纯化；利用cDNA纯化试剂盒（QIAGEN）对上一步反转录获得的cDNA进行纯化后，即可获得qPCR的模板；置于-20℃保存备用；

荧光定量PCR：

1）使用软件Primer Premier 5.0设计上下游引物；

2）将柔嫩艾美耳球虫敏感株卵囊的cDNA作为标准品，按照1:10的比例，倍比稀释成5个浓度梯度以制作标准曲线；

3）以上述制备的虫体cDNA作为模板，18s rRNA作为对照，采用SYBR Green I三步法以检测基因在不同虫株的mRNA转录水平的高低；

PCR反应结束后以18s rRNA的结果作为对照，通过计算获得目的基因的相对扩增量；为减小误差，每个样品至少设置三个重复；

对mRNA转录水平进行分析获得鸡球虫对不同药物的耐药程度。

4.一种快速检测球虫耐药性分子标记的应用，所述应用为利用球虫耐药性分子标记区分敏感株与不同耐药株，具体为采用qPCR的方法比较基因EtENO2、EtPGK和EtAKRO的mRNA的转录水平在不同虫株中的差异。

5.一种快速检测球虫耐药性分子标记的检测试剂盒，所述试剂盒包括可以分别扩增柔嫩艾美耳球虫烯醇酶2（EtENO2）、磷酸甘油酸激酶（EtPGK）、醛酮还原酶家族的氧化还原酶（EtAKRO）的引物对；

所述的引物对为：

如权利要求5所述的一种检测试剂盒的应用，所述引用为检测样品中球虫，所述样品包括但不限于生物样品、食品、水源、土壤等。