[发明专利]一种可以快速检测鸡球虫耐药性的分子标记、检测方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种可以快速检测鸡球虫耐药性的分子标记、检测方法及试剂盒。本发明中克隆了3个耐药相关基因EtENO2、EtPGK和EtAKRO。比较了3个基因在实验室诱导的两个耐药株（地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株）和药物敏感株的mRNA的转录水平差异以及蛋白的翻译水平差异，同时检测了田间分离株的耐药性，为今后进一步研究球虫耐药性产生的分子机理及建立快速检测田间球虫耐药性提供了理论基础。

技术领域

本发明涉及疾病检测辅助领域，特别是一种可以快速检测鸡球虫耐药性的分子标记、检测方法及试剂盒。

背景技术

鸡球虫病是由几种艾美耳属球虫寄生鸡肠道引起的一种极为常见的致死性流行病，严重危害鸡的生长发育，是集约化养鸡业危害最大的疾病之一，该病每年都给全球家禽养殖业带来巨大的经济损失。由于球虫疫苗的稳定性较差，目前球虫病的防控主要依靠药物，随着抗球虫药物在规模化养鸡场的长期使用，导致球虫极易产生耐药性，鸡场球虫的耐药性问题已非常严重。自1954年，美国从鸡场分离到对磺胺类药物具有耐药性的虫株后，各国学者都陆续报道了鸡球虫耐药株，迄今为止，已从养鸡场分离出几乎对所有抗球虫药有耐药性的虫株，而且出现了多重或交叉耐药性虫株。球虫耐药性的产生，特别是多重或交叉耐药性的出现，造成很多药物的抗球虫效果不佳，甚至是失效，导致养鸡场无药可选、无药可用，已成为当前球虫病防控中最主要的障碍之一。由于耐药性的普遍性和危害的严重性，各国学者对球虫耐药性产生的原因及其机制进行了研究。但至今还没有弄清楚鸡球虫耐药性产生的分子机理，也没有找到控制球虫产生耐药性的靶基因，无法解释鸡球虫耐药性产生的分子机制，还无法对现场球虫耐药性进行快速检测。但鸡球虫和疟原虫同属于顶复门原虫，都是细胞内寄生。由于疟原虫寄生引起的疟疾威胁着人类的健康，该病的治疗主要是用青蒿素类药物或者以青蒿素类药物为基础的联合用药，因此疟原虫对青蒿素类药物产生耐药的机制一直是国内外学者关注的焦点。研究显示恶性疟原虫13号染色体上的k13-螺旋桨基因（pfkelch13）某些位点的突变导致其构象改变，减少了与作用分子磷脂酰肌醇-3激酶（PfPI3K）的结合，降低了PfPI3K的多聚泛素化，使PfPI3K的表达量增加，从而增加了PfPI3K效应分子磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P）的水平，诱导其对青蒿素产生耐药性。对其他顶复门原虫弓形虫的研究发现与敏感株相比，棒状体激酶家族蛋白（ROP2A）的表达水平在弓形虫磺胺嘧啶耐药虫株呈显著上调，膜骨架蛋白（IMC 1）和烯醇化酶2（Enolase2）表达水平呈显著下调。这些研究表明顶复门原虫对药物产生耐药的机制复杂，除了与基因的突变有关，还与基因的表达差异有关。

目前现场球虫对药物是否产生耐药性的检测需要通过本体动物临床试验，费用高、周期长，且需要大量人力。鸡球虫一旦对某种药物产生耐药性后，该种药物的防治效果大大降低，甚至失效。由于现场长期使用多种抗球虫药，使球虫同时对多种抗球虫药物产生耐药性，出现了多重或交叉耐药性虫株，可能造成养鸡场对球虫病的防治出现无药可选、无药可用的状况。而目前由于球虫耐药性产生的分子机制不清楚，对现场球虫耐药性检测还是需要通过鸡体药物敏感性试验，周期长，延误了现场球虫病的防治。因此，寻找鸡球虫耐药性产生的标记基因是球虫耐药性研究的重要基础，对控制某一特定药物或多种药物耐药性基因的鉴定，建立快速检测现场球虫耐药性的检测方法，可以快速监测耐药性的蔓延、延缓现有药物的使用时间和效果、增加指导用药策略的有效性，可以帮助理解药物耐药性产生的分子基础，并促进新型药物的研制，可从根本上防止球虫耐药性的产生。

目前鸡球虫耐药性检测只能是通过鸡体药物敏感性试验，需要饲养大量鸡只，饲喂药物后感染一定量的现场球虫，一般接种后第7或8 天通过鸡只增重、病变记分、卵囊产量等来计算相对卵囊产量（ROP）、最适抗球虫活性百分比（POAA）、病变记分减少率（RLS）、抗球虫指数（ACI）四项指标来综合判断球虫对药物的耐药程度。该方法则比较繁琐，费时，费力，且需要训练良好的专家才能进行判断，由于试验周期长，很大程度上会导致现场球虫病治疗上的延误。