[发明专利]水稻糊粉层特异表达启动子pNFYA1及其应用

权利要求书

1.一种水稻糊粉层特异表达启动子pNFYA1，其特征在于，所述水稻糊粉层特异表达启动子pNFYA1的片段大小为1965bp，DNA序列见序列表SEQ ID No:1。

2.一种水稻糊粉层特异表达启动子pNFYA1的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

提取水稻品种ZH11的叶片基因组DNA作为模板，用引物F1：5'-AAGCTTATGATGGCTCGTCTTCCTC-3'和

引物R1：5'-CTGCAGCCTCCTTCGTTGTCTCCTA-3'，按常规PCR体系进行扩增，得到目的片段；

回收片段长度为1977bp的所述目的片段，将所述目的片段连接到pGEM-T-Easy载体上，并通过热激法转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞；

将所述目的片段转入所述感受态细胞后，经菌液PCR筛选获得所述目的片段的阳性克隆，所述阳性克隆的核苷酸即为所述水稻糊粉层特异表达启动子pNFYA1。

3.根据权利要求2所述的水稻糊粉层特异表达启动子pNFYA1的制备方法，其特征在于，所述按常规PCR体系进行扩增的步骤，包括：

将所述模板、所述引物F1和所述引物R1在95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个循环，最后72℃ 10min。

4.一种重组载体的制备方法，其特征在于，所述重组载体包含采用权利要求2或3所述的水稻糊粉层特异表达启动子pNFYA1的制备方法制取的水稻糊粉层特异表达启动子pNFYA1，所述重组载体的制备方法包括下列步骤：

提取所述阳性克隆的质粒，用Hind III和Pst I双酶切，DNA凝胶电泳，切胶，随后用GelExtraction Kit胶回收试剂盒获得启动子pNFYA1片段；

pCAMBIA1301-GUS质粒2μg、酶切10x Buffer 5μL、Hind III 1μL和Pst I 1μL用双蒸水补足到50μL，在37℃中酶切处理4小时，回收片段长度为11677bp的线性化pCAMBIA1301-GUS；

采用线性化pCAMBIA1301-GUS载体0.5μL、启动子pNFYA1片段1μl、T4 DNA连接酶0.5μL和T4 DNA连接缓冲液5μL，用双蒸水补足到10μL，在16℃下反应10h，得到重组产物；

将所述重组产物和大肠杆菌DH5α感受态细胞，利用热激法转化提取得pNFYA1-GUS质粒，所述pNFYA1-GUS质粒即为重组载体。

5.一种根据权利要求4所述的水稻糊粉层特异表达启动子pNFYA1在培育转基因水稻中的应用，其特征在于，包括：采用权利要求4所述的重组载体的制备方法构建重组载体；将所述重组载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育。