[发明专利]水稻糊粉层特异表达启动子pNFYA1及其应用

说明书

本发明涉及一种水稻糊粉层特异表达启动子pNFYA1及其应用，其中水稻糊粉层特异表达启动子pNFYA1的片段大小为1965bp，DNA序列见序列表SEQ ID No:1。本发明提供的水稻糊粉层特异表达启动子pNFYA1在淀粉胚乳中表达很低，在糊粉层区域则表现为高表达，并且该水稻糊粉层特异表达启动子只在种子灌浆期和萌发期的胚乳糊粉层中特异表达，可以更加有效地针对水稻进行品种改良，为稻米品质改善提供便捷途径，另外该启动子的特性还可作为种子筛选标记，通过对萌发后的种子进行染色分析，从而区分转基因和非转基因。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种水稻糊粉层特异表达启动子pNFYA1及其应用。

背景技术

启动子是指基因中一段能准确有效地起始转录的顺式作用元件，通常是位于基因上游的DNA序列。组织特异性启动子又叫器官特异性启动子，该种启动子所调控的下游基因的表达，常常只发生在特定的组织或器官部位，并表达出发育调节的特性。

近年来，为了便于外源基因在植物体内高效地发挥作用，人们对组织特异性启动子的结构和功能进行了深入研究。目前发现了一系列组织特异性启动子，如水稻根尖特异表达启动子PosRo3、水稻柱头特异强启动子OsSti1、植物种子特异表达启动子OsSee1和植物胚乳特异性启动子pEnd1等。在基因工程的研究中也需要具有组织特异表达的启动子，使外源基因能在特定的组织部位高效表达。

禾谷类作物种子尤其是胚乳，是人类食物的主要来源。胚乳的形成和发育直接影响着水稻的产量的品质，同时胚乳也是一个优良的重组蛋白表达系统，来表达人们所需要的特定氨基酸和维生素等，也可用来生产在医疗和工业领域中具有重要价值的蛋白质。禾谷类作物种子胚乳的最外层组织，称为糊粉层(aleurone layer，AL)。在灌浆期，进入胚乳的灌浆物质必须首先经过糊粉层才能进入里层的胚乳。经背部维管束运过来的灌浆物质中，主要有糖类和氨基酸，此外还含有钾、钙、镁等矿质。糊粉层细胞吸收并转运这些物质，把糖类和大部分氨基酸转运入内部淀粉胚乳细胞作原料，供其合成淀粉和蛋白质，而那些被留在糊粉层中沉积的属于非淀粉胚乳贮藏物质，如矿质元素和脂肪酸等。糊粉层含有很高的灰分、磷、尼克酸、硫胺素和核黄素，其中酶活性也高。

因此，糊粉层细胞是作物基因工程改良的主要靶点。然而，要精确操纵水稻的糊粉层细胞的生理生化活性，找到关键的糊粉层特异表达启动子具有重大意义。

发明内容

基于此，有必要针对上述提到的至少一个问题，提供一种水稻糊粉层特异表达启动子pNFYA1及其应用。

本发明申请第一个方面提供了一种水稻糊粉层特异表达启动子pNFYA1，水稻糊粉层特异表达启动子pNFYA1的片段大小为1965bp，DNA序列见序列表SEQ ID No:1。

第二个方面，本发明申请提供了一种水稻糊粉层特异表达启动子pNFYA1的制备方法，包括下列步骤：

提取水稻品种ZH11的叶片基因组DNA作为模板，用引物F1：5'-AAGCTTATGATGGCTCGTCTTCCTC-3'和

引物R1：5'-CTGCAGCCTCCTTCGTTGTCTCCTA-3'，按常规PCR体系进行扩增，得到目的片段；

回收片段长度为1977bp的目的片段，将目的片段连接到pGEM-T-Easy载体上，并通过热激法转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞；

将目的片段转入感受态细胞后，经菌液PCR筛选获得目的片段的阳性克隆，阳性克隆的核苷酸即为水稻糊粉层特异表达启动子pNFYA1。

在第二个方面的某些实现方式中，按常规PCR体系进行扩增的步骤，包括：

将模板、引物F1和引物R1在95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个循环，最后72℃10min。