[发明专利]一种鸡EZH2蛋白的原核表达与纯化方法的研究方法

权利要求书

1.一种鸡EZH2蛋白的原核表达与纯化方法的研究方法，其特征在于：包括步骤

S1.样品的制备与处理

收集PET-32a-EZH2和PET-32a菌液，超声破碎后分别取其上清和沉淀，即为蛋白样品；

S2.SDS-PAGE凝胶电泳观察

配制凝胶，对经步骤S1处理得到的样品进行SDS-PAGE凝胶电泳观察，若存在于上清则为分泌性表达；反之则为包涵体形式表达；

S3.EZH2蛋白原核表达条件的优化；

S4.样品的纯化

在EZH2原核表达载体的最优表达条件下对经步骤S3表达的样品使用His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化，得到条带在90KD的EZH2的单一蛋白条带。

2.根据权利要求1所述的一种鸡EZH2蛋白的原核表达与纯化方法的研究方法，其特征在于：步骤S1所述的样品的制备与处理过程包括：

S101.挑取PET-32a-EZH2和PET-32a单菌落，接种到4ml LB+A液体培养基，过夜培养；

S102.按照1:100的比例取培养过夜的菌液，接种到4ml的2YT+A液体培养基，恒温震荡培养4h；

S103.加IPTG诱导剂，29℃，180r/min的条件下继续培养7h；

S104.收集菌液，PBS洗两遍，然后加入200ulPBS重悬；冰水浴中进行超声波破碎，离心，分别收集上清和沉淀，即为蛋白样品。

3.根据权利要求1所述的一种鸡EZH2蛋白的原核表达与纯化方法的研究方法，其特征在于：步骤S2所述的SDS-PAGE凝胶电泳观察的过程包括：

S201.首先配制12％分离胶，凝固后配制5％浓缩胶；

S202.蛋白样品加上样液煮沸10min，冷却后进行点样；

S203.80V跑浓缩胶、120V跑分离胶；

S204.电泳结束后取出凝胶，加染色液于脱色摇床上染色50min；

S205待染色完成后回收染色液，倒入脱色液对凝胶进行多次脱色；

S206.凝胶成像系统观察，对目标蛋白条带所处胶片的位置进行分析。

4.根据权利要求1所述的一种鸡EZH2蛋白的原核表达与纯化方法的研究方法，其特征在于：步骤S3所述的EZH2蛋白原核表达条件的优化过程包括：

S301.诱导温度的优化表达；

S302.诱导时间的优化表达；

S303.IPTG诱导剂浓度的优化表达。

5.根据权利要求4所述的一种鸡EZH2蛋白的原核表达与纯化方法的研究方法，其特征在于：表达条件为温度为29℃、诱导剂浓度为1.0mM IPTG和诱导时间为8h的条件是EZH2原核表达载体的最优表达条件。

6.根据权利要求1所述的一种鸡EZH2蛋白的原核表达与纯化方法的研究方法，其特征在于：步骤S4所述的样品的纯化过程包括：

S401.收集细菌沉淀并称重，每克细菌沉淀湿重加入4ml非变性裂解液的比例加裂解液重悬菌体；

S402.加入溶菌酶至1mg/ml并轻轻混匀，冰水浴30min；

S403.冰上超声裂解细菌，4℃、10000g下离心30min，将离心后的上清收于EP管中置于冰水浴或冰上；

S405.取1ml混合均匀的50％BeyoGold^TMHis-tag螯合剂胶体，4℃离心(1000g×10s)弃去储存液，向纯化柱中的凝胶中加入0.5ml非变性裂解液，4℃离心(1000g×10s)弃平衡液，重复平衡2-3次之后加入细菌裂解液上清；

S406.将穿流液收集并重复上柱3-5次；

S407.用0.5ml非变性洗涤液洗柱5次，收集每次洗涤液用于分析检测；

S408.用0.5ml非变性洗脱液洗脱6-8次，收集洗脱液到标记好洗脱次数的EP管中；收集的洗脱液中即为纯化的蛋白样品。