[发明专利]一种鸡EZH2蛋白的原核表达与纯化方法的研究方法

说明书

本发明公开了一种鸡EZH2蛋白的原核表达与纯化方法的研究方法，本方法在构建pET‑32a‑EZH2原核表达载体的基础上，在控制其他变量一致的条件下分别设计不同的诱导温度、诱导剂IPTG的浓度、诱导时间等条件对鸡EZH2原核蛋白的表达条件进行优化，由此得出EZH2蛋白原核表达的最优条件是温度29℃、诱导剂浓度1.0mMIPTG、诱导时间8h；并在最优条件下对原核表达蛋白进行纯化得到大量的目标蛋白，最终得到的蛋白大量分布在裂解上清液中，表明目的蛋白呈可溶性表达，本实验可为日后研究鸡EZH2蛋白在鸡肿瘤性疾病中的作用机制和蛋白功能提供材料。

技术领域

本发明涉及生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种鸡 EZH2蛋白的原核表达与纯化方法的研究方法。

背景技术

在我国养鸡业飞速发展的同时，也仍然存在一些问题，比如禽产 品质量仍有待提高，疾病控制力度仍有待加强、饲养管理环境仍有待 完善；在这之中，如何有效的控制疾病仍然是养殖业的首要解决问题， 虽然我们已经在免疫程序、疫苗生产和其他一些疾病预防方面取得了 突出的研究进展，但疾病带来的危害仍不容忽视，疾病的治疗依然刻 不容缓；随着科学研究的发展，一些传染性疾病和普通疾病相继得到 了控制，因此，作为严重危害养鸡业的重要疾病之一—肿瘤性疾病， 显得越发重要；由于肿瘤的发病机制在基因水平上得到了阐明，肿瘤 的基因治疗方法得到了迅速发展；通过对肿瘤性疾病的基因治疗方法，可以进一步了解肿瘤性疾病，我们也能够更好的控制肿瘤性疾病的发 生、发展以及传播，促进养禽业的健康发展；

EZH2(enhancer of zeste homolog 2)是PRC2的成分，又可以称 之为组蛋白赖氨酸甲基转移酶；表观遗传学领域的研究和实验已经证 明靶向EZH2抑制剂可抑制PRC2的致癌活性，能够对癌细胞的发生、 入侵与扩散形成一定的阻碍作用；由此可见EZH2在靶向治疗恶性疾 病领域中的重要意义，但是在畜禽领域相应的研究还是相对较少；

在利用EZH2靶向治疗恶性疾病的过程中，鸡EZH2蛋白的表达 是EZH2靶向治疗效果的主要表征，因此如何精准的控制EZH2蛋白 的表达变成了畜禽领域疾病防治探索的一个主要课题。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种鸡EZH2蛋白的原核 表达与纯化方法的研究方法，通过本方法确定了EZH2蛋白的最优表 达条件，为后续研究EZH2蛋白在鸡恶性肿瘤性等其他疾病中的作用 机制提供科学数据。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种鸡EZH2蛋白的原核表达与纯化的方法，包括步骤

S1.样品的制备与处理

收集PET-32a-EZH2和PET-32a菌液，超声破碎后分别取其上清 和沉淀，即为蛋白样品；

S2.SDS-PAGE凝胶电泳观察

配制凝胶，对经步骤S1处理得到的样品进行SDS-PAGE凝胶电 泳观察，若存在于上清则为分泌性表达；反之则为包涵体形式表达；

S3.EZH2蛋白原核表达条件的优化

根据不同的温度、表达时间和IPTG诱导浓度等，在通过设置唯 一变量的情况下，探索得到其最优的表达条件。

S4.样品的纯化

在EZH2原核表达载体的最优表达条件下对经步骤S3表达的样 品使用His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化，得到条带在90KD的EZH2 的单一蛋白条带。

优选的，步骤S1所述的样品的制备与处理过程包括：

S101.挑取PET-32a-EZH2和PET-32a单菌落，接种到4ml LB+A 液体培养基，过夜培养；