[发明专利]一种高品质的青贮构树发酵方法

权利要求书

1.一种高品质的青贮构树发酵方法，包括以下工作步骤：

步骤一：选定青贮原料，青贮原料为第三茬全株杂交构树，刈割高度离地15cm，自然风干30min后，用铡草机切碎为1.5-2.5cm小段进行青贮封装；

步骤二：设置对照组CK和对比组P97、P94和P91，其中P97内部添加浓度为3％的玉米淀粉液，P94内部添加浓度为6％的玉米淀粉液，P91内部添加浓度为9％的玉米淀粉液；

步骤三：MRS培养基的准备:

(A)将10g蛋白胨、5g牛肉粉、4g酵母粉、2g葡萄糖、1ml吐温80、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰、15g琼脂粉加入无菌培养瓶中，随后添加1000ml蒸馏水中混合均匀；

(B)对(A)中的混合液进行加热溶解；

(C)利用pH计对(B)中的混合液的酸碱值进行检测，并将pH调整至5.5-6.7；

(D)将调制好的MRS培养基，并予以编号1-30；

步骤四：菌种接种培养：

(一)将步骤一中切碎的构树树叶和编号1-15的MRS培养基分别装入PVC真空封口袋进行分装处理，随后集中高温灭菌15-20分钟；

(二)将(一)中的分装处理后的MRS培养基在实验室中避光储存60天后开封。

步骤五：使用钙圈溶法对菌种分离纯化；

(A)将步骤二中发酵好的溶液稀释；

(B)在稀释后的溶液中添加10-12mlMRS培养基，凝固后注入4-5ml水琼脂培养基，制成厌氧环境，在30℃-37℃中培养2-4天，出现出现针头状或圆形稍扁菌落，周围形成透明圈；

(C)挑取培养基变黄、透明圈较大的菌落，反复划线纯化2-3次，并分装予以编号；

(D)通过镜检，将乳酸菌中接种于编号16-30的MRS培养基中，25-36℃中培养1-3天；

(E)穿刺于编号16-30的MRS培养基中碳酸钙半固体进行筛选处理，25-36℃中培养1天；

步骤六：性能检测，包含有发酵指标测定、微生物多样性测定、发酵品质测定。

2.根据权利要求1所述的一种高品质的青贮构树发酵方法，其特征在于：所述发酵指标测定指标包含有pH、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸和氨态氮。

3.根据权利要求2所述的一种高品质的青贮构树发酵方法，其特征在于：所述pH的检测通过使用pHS-3CpH仪，所述氨态氮的检测通过使用苯酚-次氯酸钠比色法进行测定，所述乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的测定采用高效液相色谱仪型号为Agilent1260，色谱柱型号Agilent5TC-C18(25×4.6mm)，流速0.8ml/min。

4.根据权利要求2所述的一种高品质的青贮构树发酵方法，其特征在于：所述微生物多样性的分析基于PacBio平台，采用SMRT方法对青贮饲料中微生物的基因进行测序，之后通过CCS序列进行过滤、聚类和去噪，并进行物种注释及丰度分析。