[发明专利]一种液体活检肿瘤细胞DNA适配体

权利要求书

1.一种液体活检肿瘤细胞DNA适配体，其特征在于：包括以细胞表面表达的Vimentin蛋白为靶向蛋白CSV，采用whole-cellSELEX技术筛选出相应的核酸适配体CSV-Aptamer。

2.根据权利要求1所述的一种液体活检肿瘤细胞DNA适配体，其特征在于：采用所述whole-cell SELEX技术筛选出相应的核酸适配体CSV-Aptamer的方法具体包括：

S1、设计并合成一个含1014-1015个随机序列的核酸库，每个随机序列由两端已知的引物区和中间随机区组成；

S2、将随机核酸库与目标生物靶点孵育，形成核酸适配体-靶点复合体；

S3、将与靶点结合的核酸适配体与其他核酸分子进行分离；

S4、将与靶点结合的核酸适配体通过PCR扩增，形成一个富集的次级核酸库，将其与靶点重新孵育，进行下一轮筛选；

S5、经过8-20轮筛选，当富集程度达到饱和后，对富集的核酸库进行测序分析，鉴定特异性核酸适配体序列；

S6、为消除非特异核酸分子与靶点的结合，在SELEX过程中引入2-5轮负向筛选，即采用前期构建的Vimentin-KO细胞系，将会显著提将筛选得到的PCR产物克隆到质粒中，采用随机挑选100个克隆一代测序和PCR产物直接高通量测序相结合，分析筛选得到的Aptamer序列，并纯化获得更多的Aptamer分子，再与野生型肿瘤细胞和基因敲除细胞系做亲和度和特异性检测，选取最优序列的Aptamer分子。

3.根据权利要求2所述的一种液体活检肿瘤细胞DNA适配体，其特征在于：所述步骤S1中中间随机区为30-50个碱基。

4.根据权利要求2所述的一种液体活检肿瘤细胞DNA适配体，其特征在于：所述步骤S6中将最优Aptamer进行荧光化学基团修饰，与各类肿瘤细胞系结合，通过流式细胞仪检测肿瘤细胞的检出率，再采用临床血液标本检测CTC，对照临床资料，分析CSV-Aptamer在临床中的检出率和恶性肿瘤的相关性。

5.根据权利要求2所述的一种液体活检肿瘤细胞DNA适配体，其特征在于：研究筛选出来的CSV-Aptamer在野生型肿瘤细胞系中的作用分析具体如下：将筛选出来的CSV-Aptamer加入培养的各种野生型肿瘤细胞系，观察其对肿瘤细胞的影响，分析其作为靶向治疗的潜力。

6.根据权利要求5所述的一种液体活检肿瘤细胞DNA适配体，其特征在于：将筛选出来的适配体CSV-Aptamer改造成携带各种药物靶向肿瘤细胞的治疗方法。