[发明专利]一种液体活检肿瘤细胞DNA适配体

说明书

本发明公开了一种液体活检肿瘤细胞DNA适配体，包括以细胞表面表达的Vimentin蛋白为靶向蛋白CSV，采用whole‑cell SELEX技术筛选出相应的核酸适配体CSV‑Aptamer，本发明涉及生物工程技术领域。该液体活检肿瘤细胞DNA适配体，可实现以细胞表面表达的Vimentin(波形蛋白)蛋白(CSV)为靶向蛋白，采用whole‑cell SELEX技术筛选出相应的核酸适配体(CSV‑Aptamer)，并将筛选出来的核酸适配体进行功能研究，开发出在早期诊断和治疗中的用途。前期利用crisp‑9技术构建了Vimentin基因敲除的肿瘤细胞系，可以作为筛选核酸适配体过程中非常关键的阴性对照细胞系，通过筛选Vimentin阳性细胞和阴性细胞，双向筛选，达到快速筛选出目标分子的目的，具有高筛选效率和成功率。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体为一种液体活检肿瘤细胞DNA适配体。

背景技术

根据世界卫生组织最新公布的数据，2020年有1930多万新发癌症病例，有1000万人死于癌症。全球癌症死亡人数占总死亡人数的近六分之一。预计到2030年这一数字将增加到2100多万。目前，早期诊断和早期治疗仍然是肿瘤预防和治疗的关键。临床上的早期诊断主要依赖影像学检查，比如B超和CT，但其在恶性肿瘤确诊方面存在不足，肿瘤组织病理学诊断仍是肿瘤确诊的主要手段。但由于肿瘤组织的异质性，肿瘤组织块常常不能完全反映体内肿瘤的真实情况，且往往标本难以获得。在缺乏有效的早期检测方法的情况下，患者在肿瘤确诊后常已经处于晚期或已经远处转移。因此，临床急需一种快速、无创、方便、准确的肿瘤早期检测方法。

近年来，液体活检(liquid biopsy)在肿瘤检测中的应用越来越受到人们的重视。液体活检使用病人的血液或尿液作为样本，因此比较容易获得，且损伤微小或无创，细胞表面表达的Vimentin(Cell Surface Vimentin，CSV)作为一种仅在肿瘤细胞上表达，而不存在于正常细胞表面的生物标志物，而且其作为EMT过程中过度表达的关键蛋白，有可能成为体外液体活检中筛选CTC的，能反映出肿瘤恶性程度的独特标志物，具有重要的临床指导意义。

随着研究的不断深入，Vimentin逐渐被公认为EMT的权威标志物，在肿瘤研究中发挥着重要作用，经研究测试，结果表明，该抗体能特异性地结合血液中肿瘤细胞的细胞表面Vimentin，有效地提高了检出率，同时，抗体与细胞表面Vimentin结合可导致肿瘤细胞死亡，而不影响正常细胞的存活，也显示了这一方法在肿瘤治疗方面的潜在价值。但抗体由于具有高免疫原性、稳定性差、化学修饰困难、生产方法有限及生产成本昂贵等缺点，在一定程度上限制了其临床应用。

核酸不仅是遗传信息的载体，也是生物体内具有生物活性的重要功能分子。一些单链核酸具有与蛋白质一样复杂的三级结构，可以进行配体结合、催化和基因表达调控等化学反应，称为核酸适配体(Aptamer)。Gold及其学生Tuerk利用大容量的随机核酸库及体外PCR扩增技术，筛选到能特异结合噬菌体T4 DNA多聚酶的RNA分子，并将这一技术命名为基于指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment，SELEX)，与抗原抗体反应一样，适配体以构象互补模式特异识别靶点，并以高亲和力与其结合。此外，由于小分子核酸的理化性质，核酸适配体在临床应用和生产中具有许多优势：如无/低免疫原性，组织渗透快，细胞内能力强，能识别更广泛的靶点等，提高了核酸适配体的临床应用潜力。同时，简单而经济的固相合成技术的发明使核酸适配体更易于大规模生产。由于具有同样的高亲和力、高特异性和靶结合能力，在化学修饰、稳定性和生产成本等方面具有明显的优势，核酸适配体取代或补充了上述抗体技术的不足，在肿瘤诊断中得到了广泛的应用。例如，核酸适配体可用于液体活检中循环肿瘤细胞(CTC)检测、免疫组织化学分析和体内成像。因此，靶向CSV的核酸适配体未来同样有可能被用于早期检测肿瘤细胞，确定预后，临床治疗和评估药物疗效等方面，而且易于构建、易于生产。