[发明专利]一种促使间充质干细胞产生外泌体的试剂盒

权利要求书

1.一种提高细胞外泌体产量的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供一干细胞；

(b)在合适的培养条件下，使用第一培养液，对所述干细胞进行预培养，从而获得融合度为60-90％的经预培养的干细胞；

其中，所述第一培养液为含有血小板裂解物的αMEM培养基；

(c)使用第二培养液对所述经培养的干细胞进行孵育培养24～48小时，从而获得一孵育培养液，所述孵育培养液含经孵育培养的干细胞以及由经孵育培养的干细胞所产生的细胞外泌体；

其中，所述第二培养液为含有血小板裂解物的αMEM培养基经超速离心、过滤和超滤后得到的超滤液；和

(d)从上一步骤获得的所述孵育培养液中分离出细胞外泌体。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞为体外传代培养2代(P2)至6代(P6)的干细胞，优选体外传代培养4代(P4)的干细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培养液中血小板裂解物的浓度为2％～15％，较佳地，5％～10％，最佳地5％，其中所述百分比为体积百分比。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二培养液中血小板裂解物的浓度为2％～15％，较佳地，5％～10％，最佳地5％，其中所述百分比为体积百分比。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二培养液使用以下方法制备：

(i)提供一含有2％～15％血小板裂解物的αMEM培养基；

(ii)将所述含有2％～15％血小板裂解物的αMEM培养基超速离心6～24小时，从而得到离心后的上清液；其中，所述超速离心的转速为100000～120000g，较佳地，100000g；更佳地，120000g；

(iii)使用0.22μm～0.45μm(较佳地，0.22μm)孔径的滤器对所述离心后的上清液进行过滤，从而得到过滤后的滤液；

(iv)使用100～300KD(较佳地，300KD)孔径大小的超滤管对所述过滤后的滤液进行超滤，从而得到超滤液，即获得所述第二培养液。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二培养液具有以下特征：

(1)含有2％～15％的血小板裂解物；

(2)几乎不含有血小板裂解物中的外泌体；

(3)使间充质干细胞保持较优地增殖能力；

(4)使间充质干细胞保持较优地干细胞特性；和

(5)促使间充质干细胞分泌较多的外泌体。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，孵育培养的时间为24-72小时，较佳地，24-48小时，最佳地48小时。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中，包括：

(d1)对所述孵育培养液进行分离，从而获得无细胞的上清液，其中所述上清液含有所述的细胞外泌体；

(d2)将所述步骤(d1)中的上清液与聚乙二醇(PEG)溶液过夜孵育，从而获得一混合液；

(d3)对所述步骤(d2)中得到的混合液进行分离，从而获得沉淀，其中所述沉淀中含有所述的细胞外泌体。

9.一种细胞外泌体，其特征在于，所述细胞外泌体是通过权利要求1所述的方法获得的。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：

(Z1)人体干细胞；

(Z2)第一培养液和第二培养液；其中，所述第一培养液为含有2％～15％血小板裂解物的αMEM培养基，所述第二培养液为含有2％～15％血小板裂解物的αMEM培养基经超速离心、过滤和超滤后得到的超滤液；和

(Z3)聚乙二醇(PEG)。