[发明专利]一种促使间充质干细胞产生外泌体的试剂盒

说明书

本发明提供了一种促使人脂肪间充质干细胞生产细胞外泌体的试剂盒以及在体外促使人脂肪间充质干细胞产生细胞外泌体的方法。具体地，本发明提供了一种含有B‑300K液的试剂盒，并筛选出了用B‑300K液孵育培养人脂肪间充质干细胞产生外泌体的方法，所述B‑300K液为含有血小板裂解物的αMEM培养基经超速离心、过滤和超滤后得到的超滤液。使用本发明的试剂盒及方法，生产得到的细胞外泌体的产量具有显著提高，并且其对外泌体的宿主细胞的活性没有影响。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种促使人脂肪间充质干细胞产生外泌体的试剂盒和提高细胞外泌体产量的方法方法。

背景技术

细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是指细胞分泌的具有磷脂双分子层囊泡结构的物质，按照大小及产生机制，又可分为外泌体(exosome)与微囊泡(microvesicle)。其中，外泌体是细胞主动分泌的，是细胞间信号传导的重要途径，由细胞通过溶酶体途径，由多囊体(multi-vesicle body)与细胞质膜融合后分泌到细胞外。其主要特征包括1)大小在30-150nm，2)具有磷脂双分子层，在透射电镜下显示为杯状囊结构，3)具有CD63、CD9、CD81等四跨膜蛋白，以及TSG101，Alix等标志物。

在细胞培养过程中，通常会使用一些血清来源的因子作为培养基的添加物，特别是人来源的血小板裂解物。人血小板裂解物的优势在于其属于人源性物质，在临床上的使用可以降低动物来源的免疫原性和感染风险。有文献报道，血小板裂解物经过超滤，可以大部分去除血小板裂解物中的外泌体，且使用该培养基培养的骨髓来源的间充质干细胞的表面标志物、细胞增殖、分化潜能等，仍然保持其优越性。

综上所述，本发明需要开发一种高效提高人源脂肪间充质干细胞产生外泌体的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促使人间充质干细胞产生外泌体的方法以及生产人间充质干细胞外泌体的试剂盒。

在本发明的第一方面，提供了一种提高细胞外泌体产量的方法，包括步骤：

(a)提供一干细胞；

(b)在合适的培养条件下，使用第一培养液，对所述干细胞进行预培养，从而获得融合度为60-90％的经预培养的干细胞；

其中，所述第一培养液为含有血小板裂解物的αMEM培养基；

(c)使用第二培养液对所述经培养的干细胞进行孵育培养24～48小时，从而获得一孵育培养液，所述孵育培养液含经孵育培养的干细胞以及由经孵育培养的干细胞所产生的细胞外泌体；

其中，所述第二培养液为含有血小板裂解物的αMEM培养基经超速离心、过滤和超滤后得到的超滤液；和

(d)从上一步骤获得的所述孵育培养液中分离出细胞外泌体。

在另一优选例中，所述干细胞为体外传代培养2代(P2)至6代(P6)的干细胞，优选体外传代培养4代(P4)的干细胞。

在另一优选例中，所述干细胞为间充质干细胞。

在另一优选例中，所述间充质干细胞来源于哺乳动物，优选来源于人。

在另一优选例中，所述间充质干细胞来源于人体组织，例如脂肪、骨髓、胎盘。

在另一优选例中，所述干细胞为脂肪间充质干细胞。

在另一优选例中，在步骤(b)中，所述干细胞融合度为60-90％，较佳地，为70-90％，更佳地，为75-80％。

在另一优选例中，所述第一培养液中血小板裂解物的浓度为2％～15％，较佳地，5％～10％，最佳地5％，其中所述百分比为体积百分比。