[发明专利]一种基于CRISPR技术检测口蹄疫病毒的方法

说明书

本发明提供了一种基于CRISPR技术检测口蹄疫病毒或口蹄疫的方法，所述方法包括利用gRNA、Cas蛋白和单链核酸检测器进行检测的步骤；本发明通过对gRNA的筛选和优化，提高了检测效率，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，尤其涉及基于CRISPR技术检测口蹄疫病毒的方法、系统和试剂盒。

背景技术

口蹄疫(Foot and mouth disease)，俗名“口疮”、“辟癀”，是由口蹄疫病毒(Footand mouth disease virus)所引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。主要侵害偶蹄兽，偶见于人和其他动物。其临诊特征为口腔粘膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政治、经济损失。鉴于此，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病之首。

口蹄疫病毒的检测方法包括：RT-PCR法和ELISA血清学试验法。

本发明提供了一种新型的检测口蹄疫病毒的方法，该方法是基于CRISPR技术，尤其是基于V型Cas酶的trans活性，提供的一种特异性高、检测灵敏度高的检测方法。

发明内容

本发明提供了一种基于CRISPR技术进行口蹄疫病毒检测的方法、系统和试剂盒。

一方面，本发明提供了一种用于检测口蹄疫病毒的gRNA，所述gRNA包括与Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述靶核酸为来源于口蹄疫病毒的核酸。

本发明中，所述与CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域又称为同向重复序列、骨架区或spacer序列，该区域与Cas蛋白相互作用，从而结合Cas蛋白。

在一个实施方式中，所述gRNA自5’端至3’端依次包括与Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列。

在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有20-30个碱基，并且与SEQID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.3-6任一所示的序列；优选的，所述导向序列包含SEQ ID No.3、4、5、6任一所示的序列。

在优选的实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有20-30个碱基，例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基。

在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列包含SEQ ID No.3-6任一所示的序列，并且在SEQ ID No.3-6任一所示的序列的3’端还包括1-10个碱基(优选，1、2、3、4、5、6、7、8、9个碱基)，并且，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交；优选的，所述导向序列包含SEQ ID No.3、4、5、6任一所示的序列。

在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.3-6任一所示的序列相比，在SEQ ID No.3-6任一所示的序列的3’端连续缺失1-5个碱基(例如，1、2、3、4、5个碱基)。

所述与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交，是指上述导向序列与SEQID No.1或SEQ ID No.1的反向互补序列的连续的一段可以连续的互补配对。比如，所述与靶核酸杂交的导向序列含有30个碱基，则，导向序列的30个碱基需要与SEQ ID No.1或其互补序列的连续30个碱基互补配对。

在更优选的实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列如SEQ ID No.3-6任一所示。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白选自V型Cas蛋白，例如，Cas12、Cas14家族蛋白或其突变体。