[发明专利]一种基于密码子简并性的快速TALE表达载体构建方法

权利要求书

1.一种TALE表达载体构建方法，其特征在于，所述构建方法为通过密码子简并性构建获得TALE三联体模块，再通过TALE三联体模块按顺序拼接，连接到TALE骨架载体上形成TALE表达载体；所述TALE三联体模块为三个TALE模块的单体串联得到，包括三个重复的氨基酸序列，所述TALE三联体模块的氨基酸序列为：LTPDQVVAIASX₁X₂GGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASX₃X₄GGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASX₅X₆GGKQALETVQRLLPVLCQAHG，如SEQ ID NO:1所示；其中X₁X₂、X₃X₄、X₅X₆为NI、NN、NG、HD的任意一种组合，共64种组合；

所述构建方法包括以下步骤：

S1.通过PCR技术获得64种TALE三联体模块组合库；

S2.以三联体模块为模板，利用接头引物进行PCR，再按顺序将多个三联体进行重组串联，并同时与TALE骨架载体进行重组连接获得重组TALE表达载体；

所述步骤S2中所述按顺序将多个三联体进行重组串联为利用Golden Gate酶切连接技术进行串联；其中，在三联体扩增引物末端添加IIS限制性内切酶酶切位点，每个三联体模块酶切产生的粘性末端不同，其中第一个片段的上游粘性末端与载体酶切后的TALE的N端互补配对，下游与第二个三联体酶切片段上游互补，第二个三联体的下游与第三个三联体上游末端互补，以此类推，最后一个三联体，分别设计结合三联体第一个、第二个和第三个模块的中部，扩增获得包含最后一个模块的单体，二联体或三联体，突出的粘性末端与TALE载体的C端互补配对；

所述步骤S1具体为：

分别以SEQ ID NO:3~6为模板，以SEQ ID NO:7~8为引物，扩增得到4个片段，再以所述4个片段为模板，以SEQ ID NO:9~13为上游引物和SEQ ID NO:14~16为下游引物进行扩增，共获得64种组合的三联体模块的核苷酸片段；

所述TALE三联体模块的核苷酸序列为：CTTACACCGGATCAAGTTGTCGCTATTGCTTCTMACRDTGGTGGGAAGCAGGCATTGGAAACCGTCCAGAGACTCCTTCCCGTGCTTTGCCAAGCTCATGGACTGACTCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCMACRDTGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTCACCCCCGATCAGGTCGTTGCAATCGCATCCMACRDTGGCGGAAAACAAGCCCTGGAGACAGTGCAACGATTGCTGCCGGTCCTGTGTCAAGCACACGGC，如SEQ ID NO:2所示；

其中MACRDT分别代表AACAAT、AACATT、AACGGT、CACGAT的任意一种组合，共64种组合。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S2中所述按顺序将多个三联体进行重组串联为利用等温重组技术进行串联；

所述串联中接头引物以三联体模板库作为扩增模板，具有顺序性和方向性；接头引物扩增产物按顺序有15~25bp的重叠区域，最后一条产物下游与TALE骨架载体的C端重叠。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S2具体包括以下步骤：

S21.根据识别的目标序列调取TALE三联体模块和衔接引物对，扩增获得PCR产物；

S22.PCR产物纯化；

S23.将纯化PCR产物与TALE骨架载体1:1混合，加入相应的IIS限制性内切酶和DNA连接酶，进行Golden Gate法酶切连接反应，将三联体模块按顺序连入TALE骨架载体得到TALE表达载体。

4.根据权利要求1~3任一所述的构建方法，其特征在于，所述TALE骨架载体是可转化细菌，经克隆生长、细菌培养和质粒提取后，获得用于转染细胞的载体。