[发明专利]一种基于密码子简并性的快速TALE表达载体构建方法

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种基于密码子简并性的快速TALE表达载体构建方法。本发明针对现有TALE模块的组装需要大量载体库，以及构建过程复杂的不足，从头设计了基于引物扩增、串接和等温装配的TALE载体组装策略。本发明利用基础引物扩增出RVD模块三联体，快速获得64个三联体模块组合；然后在通过串接引物依序扩出多个三联体(或四联体)，并利用等温装配的方法构建各种TALE载体。本发明简单可行，易于掌握，载体组装过程仅需1.5到2个小时，可以快速构建靶向24bp内任意长度和组合的DNA序列的TALE载体以及TALE基础上的衍生效应子载体。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种基于密码子简并性的快速TALE表达载体构建方法。

背景技术

类转录激活效应器(TALE)蛋白家族是来自于植物病原体－黄单胞杆菌的天然细菌效应蛋白。它类似于真核生物的转录因子，通过识别特异DNA序列来调节宿主基因的转录，促进细菌定植。TALE蛋白中部包含一段由串联重复单体构成的DNA特异识别和结合区域，其中每个单体由34个重复氨基酸组成。而TALE的重复部分是由数个重复单体加约含20个氨基酸残基的0.5个重复单位构成。每个单体的第12和13位点的氨基酸却有所不同，这两个位点被命名为重复可变双残基(RVD)。每个RVD中有一个简单密码来指定识别一个特定的碱基，从而决定了TALE核苷酸结合的特异性。如NI对应A、NG对应T、HD对应C、NN对应G(Bochet al.,2009；Moscou and Bogdanove,2009)。天然形成的TALE具有大约2～34个数量不等的单体模块组成。

目前，TALE技术广泛地应用于基因组工程技术领域的多个方面，例如TALE与FokI融合形成TALE核酸酶(TALEN)，与转录调剂结构域(比如VP16和KRAB)结合形成TALE转录因子(TALE-TFs)(Gao et al.,2014)，和组蛋白修饰因子(比如LSD1)结合构建TALE染色质编辑(TALE-CEs)(Mendenhall et al.,2013)等。

TALE技术的关键是构建识别特异DNA序列的TALE载体。由于TALE序列的高度保守性，TALE串联重复序列的构建不能用常规的分子克隆方法来完成，这成为TALE应用的最大障碍。目前，构建TALE串联重复序列的主要方法包括人工合成DNA技术，基于Golden Gate的克隆技术(Cermak et al.,2011)，基于T4 DNA聚合酶不依赖连接酶的LIC克隆技术(Schmid-Burgk et al.,2013)，基于固相合成的克隆技术：如FLASH和ICA技术(Briggs etal.,2012；Reyon et al.,2012)，高通量合成技术：如FairyTALE(Liang et al.,2014)和reTALE(Yang et al.,2013)，以及基于酶切法和Gibson组装法的STAR技术(Gogolok etal.,2016)等。直接DNA合成法在TALE技术出现早期使用，现已很少使用，因为重复片段的合成易出错，且价格非常昂贵。Golden Gate法是TALEn设计和构建组装用得最为广泛的技术。该方法根据RVD识别核苷酸的规律以及在TALE蛋白中的顺序位置，分别构建包含50个RVD单元模块的质粒载体、5个末位RVD模块质粒载体、13个中间载体以及4个表达骨架载体，形成一个载体文库。TALE组装原理是根据靶序列核苷酸顺序从文库中挑出所需的不同RVD单元载体，通过特点II型内切酶切开形成多种按顺序一一对应的、特异匹配的粘性末端。经过反复酶切连接循环，实现多个RVD单元模块的有序组装。Golden Gate法构建TALE一般需要5天时间，过程繁琐、耗时且效率低。其它方法，如LIC法是基于T4DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性和聚合酶活性通过控制dNTP的渗入来实现RVD单位模块的组装。但这种方法同样需要构建大量载体库，实验步骤复杂，过程繁琐，易出错。FairyTALE和reTALE固相合成法用亲和素-链霉素系统将TALE的RVD单元模块和磁珠偶联，通过不断的添加和洗脱达到构建组装TALE模块的目的。这个过程工作量大、耗时且比较昂贵。基于Gibson法的STAR技术能在一天完成TALE组装，但同样需要大量载体库，且步骤繁琐，成功率较低。