[发明专利]构建依克多因生产菌的方法

权利要求书

1.一种构建依克多因生产菌的方法，其包括以下步骤：

A.以产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，敲减基因组中编码高丝氨酸激酶的hom基因，得到下调高丝氨酸激酶表达的菌株A；

B.敲除菌株A基因组中编码磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的pck基因，得到缺失磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的菌株B；

C.增强菌株B的基因组中编码天冬氨酸激酶的基因lysC的表达，得到过表达天冬氨酸激酶的菌株C；

D.增强菌株C的基因组中编码转酮醇酶tkt的基因tkt、编码酪氨酸解氨酶tal的基因tal和编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶zwf的基因zwf的表达，得到氧化磷酸化途径增强的菌株D；

E.在菌株D基因组中二氨基丙酸脱氢酶的编码基因ddh位点整合来源于施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri的ectABC基因，得到依克多因合成途径增强的菌株E；

F.在菌株E基因组中噬菌体转座酶IS30基因位点整合来源于施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri的ectABC基因，得到依克多因合成途径进一步增强的菌株F，筛选阳性克隆，得到依克多因生产菌。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括下述步骤：

G.在步骤F所得菌株F的基因组中进一步整合来源于施氏假单胞菌Pseudomonasstutzeri的ectABC基因，筛选依克多因合成途径增强的阳性克隆。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中所述出发菌株是Corynebacteriumglutamicum ATCC13032 LysC^fbr。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中hom基因的敲减通过使hom基因发生T176C突变而实现。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中pck基因的敲除包括下述步骤：将核苷酸序列为SEQ ID NO:2的质粒pK18mobSacB-KOpck导入宿主细胞中；进行SacB蔗糖反筛，筛选阳性克隆；

步骤C中的基因lysC表达的增强通过将lysC基因置于sod启动子下游而实现；

步骤D中的基因tkt、tal和zwf表达的增强通过用sod启动子替换其天然启动子而实现。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤E中ectABC基因在ddh基因位点的整合包括下述步骤：将核苷酸序列为SEQ ID NO:5的质粒pK18mobSacB-ddh-ECT导入宿主细胞中；进行SacB蔗糖反筛，筛选阳性克隆。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤F中ectABC基因在IS30基因位点的整合包括下述步骤：将核苷酸序列为SEQ ID NO:6的质粒pK18mobSacB-IS30-ECT导入宿主细胞中；进行SacB蔗糖反筛，筛选阳性克隆。

8.一种依克多因生产菌，其特征在于，通过如权利要求1-7中任一项所述的方法构建得到。

9.如权利要求8所述依克多因生产菌，其为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.22733。

10.如权利要求8或9所述依克多因生产菌用于生产依克多因的用途。