[发明专利]构建依克多因生产菌的方法

说明书

本发明公开了一种构建依克多因生产菌的方法，构建的基因工程菌CGMCC No.22733能够以葡萄糖为碳源，通过发酵直接生产依克多因，5L发酵罐发酵48小时，可产依克多因42.7g/L，具有开发和应用潜力。

技术领域

本发明属于代谢工程和基因工程领域，具体地说，涉及一种构建依克多因生产菌的方法、构建得到的基因工程菌及其应用。

背景技术

依克多因(Ectoin)，化学名为2-甲基-1,4,5,6,-四氢嘧啶-4-羧酸，又名四氢甲基嘧啶羧酸，易溶于水、甘油、丙二醇、乙醇等。分子为C₆H₁₀O₂N₂，结构式如下所示：

1985年，Galinski教授在埃及沙漠发现嗜盐菌在高温、干燥、强UV照射、高盐度环境下，会在细胞外层生成一种天然保护成分-依克多因，能使嗜盐菌免受伤害，从而进行自我修护；研究表明，依克多因同样对皮肤有很好的修复保护作用。他是欧莱雅、雅诗兰黛等高档化妆品采用的生物工程制剂之一，同时还可用于医疗保健，比如应激性皮炎，肺炎，过敏性鼻炎和老年痴呆症等。有文献报道，依克多因的市场售价达1000美元/公斤(Genes2018,9(4),177.)，未来具有较大市场潜力。

目前，Ectoin主要是以嗜盐菌发酵来制备，高盐发酵不仅影响发酵容器的寿命，对后续发酵废液处理也是很大的挑战。1999年，Ono等报道了高嗜盐菌(Halomonas elongata)中依克多因的合成途径并鉴定了相关酶(J Bacteriol.1999,181:91-9.)，早期发酵生产主要是使用这个菌株，同时还生成氢化依克多因。随着基因工程技术的发展，研究人员尝试用大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌等常规发酵宿主，通过基因工程改造使其产Ectoin(参见MicrobCell Fact.2021,20:76.)，大肠杆菌基因工程菌株可产25g/L依克多因，转化率达到0.11g/g葡萄糖(Metabolic Engineering.2016,36:10-18.)；Becker等以谷氨酸棒杆菌为宿主菌构建了高产赖氨酸的基因工程菌株，发酵浓度可达120g/L(Metabolic Engineering.2011,13:159-168.)；随后，他们又在谷氨酸棒杆菌LYS-1中表达了来源于Pseudomonas stutzeri的ectABC基因，并敲除lysE基因以便防止赖氨酸的外排，在低盐浓度下可产依克多因4.5g/L(Microbial Cell Factories.2013,12:110.)；Giesselmann等以Corynebacteriumglutamicum lysC^fbr作为出发菌株，通过不同的启动子组合优化ectA、ectB和ectC的表达，平衡了相关代谢流，最终获得菌株发酵56h可产65g/L依克多因(Biotechnol.J.2019,14,1800417)，转化率达到0.19g/g葡萄糖。

发明内容

发明人对已报道的谷氨酸棒杆菌中依克多因的生物合成路线进行了研究，开发出一种新的代谢路径，以产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，通过弱化hom基因，敲除pck基因，并用sod启动子增强lysC和tkt-tal-zwf的表达，然后在ddh基因位点和噬菌体转座酶IS30(IS30-like element，ISCg2 family transposase)基因位点整合ectABC基因，构建出依克多因生产菌。因此，本发明包括如下技术方案。

一种构建依克多因生产菌的方法，其包括以下步骤：

A.以产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，敲减或弱化基因组中编码高丝氨酸激酶的hom基因，得到下调高丝氨酸激酶表达的菌株A；其中，hom基因的敲减包括、但不限于敲除hom基因、下调hom基因的表达、或者弱化hom的高丝氨酸激酶的酶活力，例如可以使hom基因发生突变从而弱化高丝氨酸激酶的功能；

B.敲除菌株A基因组中编码磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的pck基因，得到缺失磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的菌株B；