[发明专利]基于特征序列设计引物的方法及系统

说明书

本发明公开了一种基于特征序列设计引物的方法，其步骤包括：将阳性序列和阴性序列进行整合；将阳性序列分割成适合进行比对的片段，并记录分割的位置；使用blast对阴性序列进行建库，然后将片段化的阳性序列比对到阴性序列进行筛选，得到一致性较低的特异性序列；使用primer3对特异性序列进行引物设计，得到上游引物、下游引物和探针的序列及位置；使用blast比对软件、阴性序列数据库、NCBI的nt数据库对得到的引物和探针进行再次筛选，并取引物和探针的交集；通过目录输出比对结果。并公开了基于特征序列设计引物的系统。本发明可以一步完成从基因组到目标序列和引物片段的引物设计。

技术领域

本发明涉及基于特征序列设计引物的方法及系统，属于引物设计领域。

背景技术

长期以来，人们对病人病因的诊断通常基于临床特征进行判断。通过临床特征选择治疗药物是有效的。但对于一些复杂的症状，仅靠临床特征进行判断是极其不准确的。上世纪八十年代的化学家发明了PCR，使得如今DNA扩增俨然已经成为了生物学研究的基础。为了能更好的判断病因，人们通过PCR设计了qPCR(定量PCR)、dPCR(数字PCR等)；

如今，由加拿大的Premier公司开发的PrimerPremier是最常用、使用最广泛的引物设计软件，其开发的分析软件Primer-Blast，Primer3 Plus，Premier5等被大量的生信工作者用以实现引物设计。设计流程从获取目标序列开始，然后根据提供的目标序列以及选择好合适的引物设计参数，从而获得引物设计结果。

目前现有的分析技术存在以下缺陷：

1.需要手动去获取目标序列；

2.在获取目标序列的过程中容易引起位置信息误差；

3.无法实现批量化设计引物需求；

4.设计结果是碎片化的，做多个引物设计时费时费力；

5.得到的引物序列还需要手动去和NCBI中的数据库比对。

发明内容

本发明的目的是提供一种特征序列设计引物的方法，自动进行目标序列的获取，并记录目标序列和引物的位置，可以一步完成从基因组到目标序列和引物片段的引物设计。

本发明采取的技术方案为：一种基于特征序列设计引物的方法，其特征在于其步骤包括：

(1)从网上(NCBI官网上下载或通过其他途径)下载需要用到基因组序列，目标序列为阳性序列，同源的其他序列为阴性序列，将阳性序列合并到一起，制作成positives.fa的fasta文件，阴性序列合并到一起，制作成negatives.fa的fasta文件；

(2)将阳性序列分割成适合进行比对的片段，并记录分割的位置；

(3)使用blast对阴性序列进行建库，然后将片段化的阳性序列比对到阴性序列进行筛选，得到一致性较低的特异性序列，并分为两级，第一级为比对到的长度小于300bp，且比对区域一致性低于70％的特异性序列，第二级为虽然比对区域的一致性高于70％但比对到的长度小于200bp的特异性序列；

(4)使用primer3对步骤(3)得到的一二级特异性序列进行引物设计，得到上游引物、下游引物和探针的序列及位置；

(5)通过blast比对软件将步骤(4)得到的引物和探针比对到步骤(3)得到的阴性序列数据库，取没有比对上的引物和探针，然后将没有比对上的引物和探针与NCBI的nt数据库进行再次比对，获得具有特异性的引物和探针；

(6)对步骤(5)的结果进行整理，并输出上下游引物、探针与序列长度。

优选的，步骤(2)中阳性序列分割大小为300bp-1000bp，在同一次引物设计过程中，分割大小应当一致。