[发明专利]测定人血浆中依折麦布、总依折麦布、阿托伐他汀及相关代谢产物的方法

权利要求书

1.一种测定人血浆中依折麦布、总依折麦布、阿托伐他汀及相关代谢产物的方法，所述相关代谢产物为邻羟基阿托伐他汀和对羟基阿托伐他汀，其特征在于，包括如下步骤：

(1)血浆样品预处理，包括依折麦布、阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀及对羟基阿托伐他汀样品处理过程和总依折麦布样品处理过程；

(2)标准曲线和质控血浆样品的配制

使用50％乙腈配制标曲和质控工作溶液，所述工作溶液包括依折麦布、阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀和对羟基阿托伐他汀的混合工作溶液以及总依折麦布工作溶液，所述总依折麦布工作溶液的质控工作溶液采用依折麦布葡萄糖醛酸配制，取上述工作溶液10μL与490μL空白血浆基质混合配制成不同浓度的标准曲线样品和质控样品，用依折麦布、阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀、对羟基阿托伐他汀及总依折麦布和内标的峰面积比和标准样品的浓度来建立标准曲线，得到相应的线性回归方程；

(3)采用液相色谱-质谱联用检测；

(4)待测血浆中各物质的浓度测定

将待测血浆按步骤(1)样品制备的方法制备，取待测样品按步骤(3)采用液相色谱-质谱联用检测的方法检测，将测得的依折麦布、阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀、对羟基阿托伐他汀及总依折麦布和各自内标的峰面积比值代入所建的标准曲线中，计算得到待测血浆中依折麦布、阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀、对羟基阿托伐他汀和总依折麦布的浓度。

2.根据权利要求1所述的测定人血浆中依折麦布、总依折麦布、阿托伐他汀及相关代谢产物的方法，其特征在于，所述步骤(1)血浆样品预处理具体步骤为：

①依折麦布、阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀及对羟基阿托伐他汀样品处理过程：在白光冰浴条件下，移取100μL待测样品至96孔板中，再加20μL氘代混合内标工作溶液，加入380μL的含0.05％乙酸的乙腈溶液，将样品涡旋10分钟后，在4000rpm、4℃条件下离心5分钟，用移液工作站移取上清液200μL至新的96孔板中，在35℃条件下氮吹；加入200μL的含0.05％乙酸的50％乙腈溶液复溶，涡旋10分钟，在4000rpm、4℃条件下离心5分钟，得到待测样品；

②总依折麦布样品处理过程：提取过程均在白光冰浴条件下进行，移取50μL待测样品至96孔板中，加入20μL相对应的氘代内标工作溶液；样品中加入100μL醋酸-醋酸钠缓冲液，加入10μLβ-葡萄糖醛酸酶稀释液，涡旋1分钟后置于微孔板恒温振荡器中50℃、1000rpm涡旋30分钟；4℃，4000rpm条件下离心3分钟；分别加入520μL的含0.05％乙酸的乙腈溶液，将样品涡旋10分钟后，在4000rpm、4℃条件下离心10分钟，用移液工作站移取100μL上清液至新的96孔板中；加入100μL的含0.05％乙酸的50％乙腈溶液稀释，涡旋5分钟，在4000rpm、4℃条件下离心5分钟，得到待测样品。

3.根据权利要求1所述所述的测定人血浆中依折麦布、总依折麦布、阿托伐他汀及相关代谢产物的方法，其特征在于，所述步骤(3)的检测条件如下：

①液相色谱条件：色谱柱：Poroshell 120EC-C18 2.7um 4.6*50mm；

流动相：水相：0.05％乙酸水，有机相：0.05％乙酸乙腈，洗针液：乙腈；

柱温：40℃；自动进样器温度：4℃；

采用水相和有机相为混合流动相进行梯度洗脱，每个样品采集时间为4.5min，进样体积为10μL，流速为0.6mL/min，流动相梯度洗脱参数如下：0min,45％有机相；3.4min,95％有机相；3.8min,95％有机相；4.2min,45％有机相；4.5min,停止。

②质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，其中依折麦布采用负离子模式，阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀和对羟基阿托伐他汀采用正离子模式，离子化电压(IS)分别为-4500V和5500V，离子源温度(TEM)：500℃，气帘气(CUR)：20psi，入口电压(EP)分别为-10V和10V，碰撞气(CAD)：9psi，雾化气(Gas1)：50psi，涡轮气(Gas2)：50psi，离子对分别为：m/z 408.3→270.8(EZE)，m/z 412.2→275.1(EZE-d₄)，m/z 559.4→440.3(ATO)，m/z 564.4→445.4(ATO-d₅)，m/z 575.3→440.2(O-ATO)，m/z 580.2→445.3(O-ATO-d₅)，m/z 575.4→440.2(P-ATO)，m/z 580.4→445.4(P-ATO-d₅)。