[发明专利]一种表达犬细小病毒2a型VP2的重组犬瘟热病毒

说明书

本发明的目的是提供一种表达犬细小病毒2a型(CPV‑2a)VP2的重组犬瘟热病毒(CDV)，其中用于拯救表达VP2的重组CDV核酸片段的结构为5′‑N‑P‑VP2‑M‑F‑H‑L‑3′；其中，N、P、M、F、H、L为CDV的结构基因；VP2为CPV‑2a VP2的开放阅读框(ORF)，该ORF上游包含M基因起始序列，下游包含P基因终止序列。本发明通过反向遗传技术拯救的重组CDV，在细胞内能有效表达VP2。重组CDV在细胞内连续传代30次，RT‑PCR分析表明，VP2基因在病毒传代过程中未被删除。

技术领域

本发明属于重组病毒构建技术领域，具体涉及一种表达犬细小病毒2a型VP2(viral protein 2)的重组犬瘟热病毒。

背景技术

犬瘟热和犬细小病毒性肠炎是犬的两种常见传染病，分别由犬瘟热病毒(caninedistemper virus,CDV)和犬细小病毒2型(canine parvovirus type 2,CPV-2)感染而引发，具有较高的发病率和致死率。CDV宿主广泛，犬科动物、鼬科动物、猫科动物等均易感染。动物感染CDV的临床症状通常是呼吸系统、胃肠消化系统、表皮黏膜和中枢神经系统症状，伴随着双相热、全身不适和病毒血症。犬细小病毒性肠炎主要表现为心肌炎(幼犬)和出血性肠炎(成年犬)。幼犬的心肌炎临床表现为突然发病，呼吸困难、心律不齐，偶见腹泻、呕吐及体温升高，病犬大多突然死亡。成年犬的出血性肠炎表现为呕吐，腹泻，排泄茄汁样血便且便稀恶臭，体温升高，食欲低下或废绝，反应迟钝，病犬迅速消瘦、衰竭、进而死亡。

CDV属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)、麻疹病毒属(Morbillivirus)成员。病毒基因组为单股、负链、线性的RNA，全长15 690nt，编码六个结构蛋白(N、P、M、F、H、L蛋白)和两个非结构蛋白(C、V蛋白)。病毒经纯化后电镜下观察形状不定，但多呈球形或椭球形，外披脂质囊膜，囊膜外表面嵌有铆钉状纤突。CDV是一种理想的病毒表达载体，可在机体内有效地表达外源抗原以诱导特异性免疫应答反应。借助反向遗传技术，可将外源抗原插入至CDV cDNA克隆，然后拯救重组CDV，进而验证其在体外和体内对于外源抗原的表达能力。

CPV-2属于细小病毒科(Parvoviridae)、原细小病毒属(Protoparvovirus)成员。CPV-2又分为三个抗原变异的亚型，分别为CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c。CPV-2基因组为单股DNA病毒，两端为“Y”字型结构。病毒粒子无囊膜，呈二十面体对称。病毒衣壳由60个亚单位构成，其中VP1为5至6个拷贝，VP2为54至55个拷贝，因此VP2在病毒粒子中起到了最关键的作用。现已证明，通过基因工程技术表达的VP2，可诱导机体产生有效的免疫保护作用。

发明内容

本发明目的是提供一种表达犬细小病毒2a型VP2的重组犬瘟热病毒(rCDV-VP2)，从而弥补现有技术的不足。

本发明提供一种用于拯救表达CPV-2a VP2的重组CDV核酸片段(rCDV-VP2 cDNAclone)，所述核酸片段的结构为5′-N-P-VP2-M-F-H-L-3′；其中N、P、M、F、H、L分别为犬瘟热病毒CDV的结构基因；VP2为犬细小病毒CPV-2a VP2的开放阅读框(ORF)；

进一步地，为了潜在提高VP2的表达效率，在VP2 ORF的5′末端添加Kozak序列；VP2ORF上游包含M基因起始序列(M GS)，下游包含P基因终止序列(P GE)。

作为实施例的一种具体记载，所述核酸片段的序列为SEQ ID NO:1；

本发明所提供的核酸片段用于在细胞内拯救能够表达犬细小病毒2a型VP2的重组犬瘟热病毒；

所述的细胞为BSR-T7/5细胞和Vero-Dog-SLAM(VDS)细胞，两者分别用于重组病毒的拯救和传代；