[发明专利]一种CRISPR-SaCas9基因编辑系统及其应用

说明书

本发明提供了一种CRISPR‑SaCas9基因编辑系统及其应用。所述基因编辑系统包括SaCas9载体、sgRNA载体和同源重组模板pDonor载体。本发明通过选择合适的SaCas9载体的核定位信号、sgRNA载体的骨架结构以及sgRNA载体的靶序列长度等多种手段，提高了mNeonGreen在人诱导多能干细胞中EEF1A1位点和GAPDH位点的基因敲入效率。同时，本发明还系统比较了不同sgRNA长度的SpCas9和SaCas9针对同一位点的打靶效率和脱靶效率，最终得知本发明提供的CRISPR‑SaCas9基因编辑系统是一种打靶效率高、脱靶效率低的新型基因编辑载体系统。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基因编辑系统及其应用，尤其涉及一种CRISPR-SaCas9基因编辑系统及其应用。

背景技术

CRISPR-Cas9是目前应用最为广泛的基因编辑工具。目前常用的CRISPR-Cas9基因编辑工具主要由两部分组成，即负责切割双链DNA的Cas9蛋白和负责通过碱基互补配对的方式识别目标DNA区域sgRNA。

CRISPR-Cas9基因编辑系统的工作原理如下：

Cas9蛋白首先和sgRNA形成RNP复合物，Cas9-sgRNA复合物寻找基因组上的PAM序列(Protospacer Adjacent Motif，原间隔区相邻基序)，并在PAM序列处识别和短暂停留。一旦sgRNA上的靶序列能够与基因组上的序列完全互补配对，Cas9蛋白会对PAM序列前第3和第4个碱基间进行切割造成DNA双链断裂(DSB)。当细胞内无外源同源重组模板的情况下，细胞通过非同源末端链接(NHEJ)的方式对DSB进行修复，这种修复是不精确的，容易造成单个或多个碱基的插入或者缺失形成Indel。如果有同源重组模板，细胞将通过同源重组(HDR)精确修复DSB，进而可以将外源基因导入目标区域，或者实现单碱基的替换等。

目前，常用的SpCas9蛋白来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)，由1368个氨基酸组成(约4.1kb)，因其体积较大限制了其在基因治疗领域中的应用。SaCas9来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Cas9，由1053个氨基酸组成(约3.3kb)，因其较小的体量和更低的脱靶效率，被广泛应用于体内基因编辑实验。编码SaCas9的基因比SpCas9小约1kb，这使得SaCas9能够更有效的组装进入容量较小的AAV等病毒载体中并且高效表达，同时为其他调节元件和sgRNA等留下更多的空间，为将SaCas9和sgRNA包装在同一AAV载体中提供可能。SaCas9的PAM识别序列为NNGRRT(R代表A或G碱基)，而SpCas9的PAM识别序列为NGG。SaCas9的PAM识别序列(NNGRRT)较长，大大增加了识别的特异性，降低了脱靶率。

综上所述，SaCas9具有较小的体积和较低的脱靶效率，在基因治疗领域具有广阔的应用前景。然而和常用的SpCas9相比，SaCas9的基因编辑效率较低。因此，进一步优化SaCas9基因编辑工具，提高其体内外基因编辑效率具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种CRISPR-SaCas9基因编辑系统及其应用。所述CRISPR-SaCas9基因编辑系统选用的核定位信号、sgRNA骨架以及sgRNA的长度，能够显著提高基因敲入效率。为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种CRISPR-SaCas9基因编辑系统，所述CRISPR-SaCas9基因编辑系统包括：SaCas9载体、sgRNA载体和同源重组模板pDonor载体；

其中，所述SaCas9载体包括启动子、SaCas9编码基因、核定位信号、Wpre和PolyA，所述核定位信号包含编码如SEQ ID NO.1～7中任意一项或至少两项所示的氨基酸序列的核苷酸。