[发明专利]一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基及方法

说明书

本发明公开了一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基及方法，涉及一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基，包括包被液、刺激培养基和扩增培养基，包被液包括DPBS磷酸缓冲液、NKp46和CD137，刺激培养基包括K581基础培养基、IL‑2、IL‑18、IL‑15、IL‑21、OK432、IFN‑γ、NEAA、谷氨酰胺、PHA和自体灭活血浆，扩增培养基包括K581基础培养基、IL‑2和AB血清。本发明避免了NK细胞与其它来源细胞共培养的问题，避免了一部分污染源，使得到的细胞不存在未知风险，更为安全；同时通过采用包被、刺激两个阶段，合理、逐步地激活NK细胞，再通过扩增阶段达到大量扩增NK细胞的目的，整个过程简单且高效。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，特别涉及一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基及方法。

背景技术

NK细胞是体内负责杀伤老化、受病毒感染、肿瘤等异常细胞的最主要“战士”。它不需要接受免疫系统的特殊指令，自己单独就能识别和攻击外来细胞、癌细胞和病毒。有研究表明：年龄超过100岁的老年人也可以有效抵抗感染，因为其NK细胞系统功能完好，而NK细胞受损的老年人易于感染流感、结核等疾病。由此可见，NK细胞尤其在维持老年人健康，保持抗感染和抗肿瘤功能中发挥着不可替代的作用。

在日本，NK细胞回输作为肿瘤治疗和抗衰保健的有效手段已经常态化；在美国，有关NK细胞的研究如火如荼；在国内，NK细胞也已走上临床研究之路。临床研究发现NK细胞过继免疫治疗恶性肿瘤具有良好的应用前景，对多种实体瘤和血液系统恶性肿瘤均有一定效果。

现有的NK细胞的制备，价格高昂，并且通常外周血与不同的基质细胞共同培养，如K562细胞等，直接刺激激活NK细胞达到NK细胞扩增的目的；然而方法中使用K562细胞具有未知风险，安全性低。有效发展肿瘤过继细胞免疫治疗的关键，是如何获得高质量且安全的可以应用于临床的NK细胞是目前需要解决的主要问题。

发明内容

基于此，本发明提供了一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基及方法，本发明避免了NK细胞与其它来源细胞共培养的问题，在降低成本的基础上还可以获得大量的高纯度高功能的NK细胞。

本发明提供了如下的第一个技术方案：

本发明涉及一种用因子法从外周血中扩增NK细胞的培养基，包括包被液、刺激培养基和扩增培养基，所述包被液包括DPBS磷酸缓冲液、NKp46和CD137，所述刺激培养基包括K581基础培养基、IL-2、IL-18、IL-15、IL-21、OK432、IFN-γ、NEAA、谷氨酰胺、PHA和自体灭活血浆，所述扩增培养基包括K581基础培养基、IL-2和AB血清。

作为本发明的一种优选技术方案，所述包被液中NKp46、CD137的终浓度为1-5ug/mL，所述刺激培养基中IL-2的终浓度为1000-2000U/mL、IL-18的终浓度为5-20ng/mL、IL-15的终浓度为5-20ng/mL、IL-21的终浓度为5-20ng/mL、OK432的终浓度为50-200ng/mL、IFN-γ的终浓度为50-200ng/mL、PHA的终浓度为0.1-1ug/mL、NEAA的终浓度为1％、谷氨酰胺的终浓度为1％、自体灭活血浆的体积分数为10％，所述扩增培养基中IL-2的终浓度为500-1000U/mL、AB血清的体积分数为10％。

作为本发明的一种优选技术方案，所述包被液中NKp46、CD137的终浓度比为1∶1，所述刺激培养基中IL-2、IL-18、IL-15、IL-21、OK432、IFN-γ和PHA的终浓度比为10∶1∶1∶1∶10∶10∶0.02。