[发明专利]用于血流感染病原微生物检测的参考品及其制备方法

权利要求书

1.一种用于血流感染病原微生物检测的参考品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：分别获得人源细胞、EB病毒、铜绿假单胞菌、近平滑念珠菌的基因组DNA；使用酶切法分别对人源细胞、EB病毒、铜绿假单胞菌、近平滑念珠菌的基因组DNA进行片段化；片段化的DNA片段长度在140~175bp之间；

S2：通过生物信息学手段分别获得结核分枝杆菌、解脲支原体、土曲霉的两段物种特异序列，再通过病原特异引物分别扩增得到所述结核分枝杆菌、解脲支原体、土曲霉的两个靶标片段，病原特异的引物序列如下表所示：

S3：对S1获得的片段化DNA和S2获得的靶标片段进行回收纯化；

S4：对S1获得的片段化DNA和S2获得的靶标片段进行定值和混合；

对S1获得的EB病毒、铜绿假单胞菌、近平滑念珠菌的片段化DNA和S2获得的结核分枝杆菌、解脲支原体、土曲霉的靶标片段单独设计一套探针引物并验证有效性；进行数字PCR定值，按照数字PCR绝对定量结果进行片段化DNA混合操作，混合后再次进行数字PCR确认混合比例准确性；

EB病毒、铜绿假单胞菌、近平滑念珠菌定值使用的引物和探针见下表：

结核分枝杆菌、解脲支原体、土曲霉定值使用的引物和探针见下表：

S5：S1获得的片段化DNA和S2获得的靶标片段和血浆混合；

将定值好的人源细胞片段化DNA和S1获得的EB病毒、铜绿假单胞菌、近平滑念珠菌的片段化DNA和S2获得的结核分枝杆菌、解脲支原体、土曲霉的靶标片段混合物投入到血浆中，病原靶标按等拷贝数进行充分混合；

S6：血流感染检测参考品的提取与质检；

提取cfDNA，对提取的cfDNA的片段大小和浓度进行测定并计算cfDNA提取效率，采用数字PCR对片段化DNA浓度和不同病原微生物间DNA比例关系进行质检验证。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S1中所述人源细胞为Hela细胞系或炎黄细胞系。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S1中所述人源细胞由培养获得。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S3中采用磁珠进行纯化，所述磁珠为1×磁珠。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S4中数字PCR的操作步骤如下：针对每种病原微生物设计特异引物和探针，取片段化DNA溶液，使用QX200数字PCR仪，对片段化DNA溶液进行精确定量，每个做3个重复，每个重复做三个复孔数字PCR，取平均值，确定病原微生物基因组片段化DNA拷贝数。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S5中混合时间为1h，所述血浆是天然血浆或人工制造的血浆。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S6中所述提取cfDNA的步骤使用市售的cfDNA提取试剂盒，所述测定并计算cfDNA提取效率使用Qsep100和Qubit4.0。

8.一种用于血流感染病原微生物检测的参考品，其特征在于，所述参考品通过权利要求1~7任一项所述的制备方法制备得到。

9.权利要求8所述的用于血流感染病原微生物检测的参考品在制备用于以下用途中的产品的应用，所述用途选自如下任意一种或多种：

（1）对基于高通量测序的血流感染检测的检测结果进行质量评估；

（2）对不同测序平台、检测流程、取样方式间结果的对比；

（3）制定基于高通量测序进行血流感染检测的技术标准。