[发明专利]用于血流感染病原微生物检测的参考品及其制备方法

说明书

本发明公开了一种用于血流感染病原微生物检测的参考品及其制备方法，包括如下步骤：（1）分别获得人源细胞和病原微生物的基因组DNA；（2）使用酶切法对人源细胞和病原微生物基因组DNA进行片段化；（3）片段化DNA的回收纯化；（4）片段化DNA的定值和混合；（5）片段化DNA和血浆混合；（6）血流感染检测参考品的提取与质检；使用上述制备方法制备得到血流感染病原微生物检测的参考品。所述参考品来源稳定，接近天然血浆样本，覆盖各类病原，定值更准确，可对基于高通量测序的血流感染检测的检测结果进行质量评估，可用于不同测序平台、检测流程、取样方式间结果的对比，制定基于高通量测序进行血流感染检测的技术标准。

技术领域

本发明涉及感染性疾病临床检测技术领域，特别涉及一种用于血流感染病原微生物检测的参考品及其制备方法。

背景技术

血流感染（bloodstream infection，BSI）是指病原微生物进入血流引起的播散感染，是危及人类生命的全身性感染疾病，主要病原微生物包括细菌、真菌及病毒等，可导致菌血症、败血症和脓毒症，严重者可引起休克、播散性血管内凝血（DIC）、多脏器功能衰竭乃至死亡。有统计数据显示，BSI占社区获得性（community-acquired，CA）和医院获得性（hospital-acquired HA）脓毒症和脓毒性休克病例的40%，约占ICU获得性病例的20%。近年来，随着侵袭性操作的不断增加及广谱抗菌药物、皮质激素等药物的不合理应用，BSI的发病率及病死率逐年上升，造成了患者住院时间的延长和经济负担的增加。因此，血流感染的控制越来越受到人们的关注，而血流感染的检测也有了更多需求。

无细胞DNA（cell-free DNA，cfDNA），即检测临床样本无菌体液中不含细胞基因组的游离片段化DNA，多数指的是血液分离血浆提取后的游离DNA。当发生血流感染时，病原体在血液中进行繁殖代谢或被白细胞吞噬，其细胞被破坏后会将胞内的DNA释放到血液中成为血浆游离DNA，因此血浆中会同时存在人源的游离DNA和病原体的游离DNA。从2015年开始，下一代测序（next-generation sequencing，NGS）方法的应用逐渐增多，市面上几种比较成熟的测序平台比如华大的BGI/MGI测序平台，赛默飞的Ion torrent，illumina公司的Miniseq/Nextseq/Hiseq等都可以对cfDNA进行检测。除了测序平台的区别，作为应用端开发的检测流程和方法更是多种多样，采血管等血液采集装置种类也数不胜数。如何对不同取样和检测流程的cfDNA检测进行效果对比和质量把控是一个尖锐的问题。虽然市面上有一些cfDNA的参考品，但几乎都是和血液肿瘤检测应用方向相关，暂未发现报道过血流感染检测的参考品。

由于二代测序技术在病原感染的临床应用近一两年才开始被临床认可，目前国外都缺乏统一的血流病原微生物感染参考品做参照以及操作规范标准，无法对不同测序平台和检测方法进行评估，因此亟需一种覆盖各类病原菌、且接近人天然血浆的血流感染病原微生物检测参考品。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种用于血流感染病原微生物检测的参考品及其制备方法，包括如下步骤：（1）分别获得人源细胞和病原微生物的基因组DNA；（2）使用酶切法对人源细胞和病原微生物基因组DNA进行片段化；（3）片段化DNA的回收纯化；（4）片段化DNA的定值和混合；（5）片段化DNA和血浆混合；（6）血流感染检测参考品的提取与质检；使用上述制备方法可制备得到血流感染病原微生物检测的参考品。

本发明提供一种用于血流感染病原微生物检测的参考品的制备方法，包括如下步骤：

S1：分别获得人源细胞和病原微生物的基因组DNA；

S2：使用酶切法对S1得到的人源细胞和病原微生物基因组DNA进行片段化；

S3：片段化DNA的回收纯化；

S4：片段化DNA的定值和混合；