[发明专利]一种高效构建cDNA文库的方法

说明书

本发明涉及cDNA文库技术领域，且公开了一种高效构建cDNA文库的方法，该高效构建cDNA文库的方法，将寡脱氧胸苷酸引物和总RNA混合物注入低盐缓冲液中退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，通过质粒和噬菌体载体制作克隆RNA的载体，使用末端转移酶对S2中获得的两条cRNA的端口添加均聚物(A)或(G)，然后对载体的端口添加均聚物(T)或(C),cRNA和末端和载体RNA末端退火后粘连，转化为重组分子。将S3中获得的重组分子经过基因培养转化后成为宿主细胞，将宿主细胞放置在琼脂平板上，通过琼脂平板中添加相应的筛选物质，直接鉴别筛选所含重组子的菌落，直接鉴别筛选所含重组子的菌落，更简便容易的确定出现在文库中的重组子。

技术领域

本发明涉及cDNA文库技术领域，具体为一种高效构建cDNA文库的方法。

背景技术

cDNA文库是指某生物某一发育时期所转录的mRNA全部经反转录形成的 cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合，具有组织或细胞特异性。 cDNA文库便于克隆和大量扩增，可以从中筛选到所需目的基因，并用于表达，但是现有的构建cDNA文库的方法仍然存在一些不足之处，比现有的构建cDNA 文库的步骤繁琐，在进行缓冲液更换时cRNA容易丢失，同时存在污染现象。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效构建cDNA文库的方法，具备简化制作步骤等优点，解决了在进行缓冲液更换时cRNA容易丢失，同时存在污染现象的问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种高效构建cDNA文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将寡脱氧胸苷酸引物和总RNA混合物注入低盐缓冲液中退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，之后通过磁分离器从低盐缓冲液分理出磁性球珠，再加入洗脱缓冲液，重复磁性分离步骤，将寡脱氧胸苷酸引物从 mRNA中解离获得杂合分子；

S2：将S1中获得的杂合分子通过反转录酶催化获得第一条cRNA链，之后用核糖核酸酶水解杂合分子中的RNA链，获得小片段RNA为合成第二条 cRNA链的引物，之后加入DNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸三磷酸，最后加入异柠檬酸脱氢酶和大肠杆菌DNA连接酶，将各片段连接获得第二条cRNA链；

S3：通过质粒和噬菌体载体制作克隆RNA的载体，使用末端转移酶对S2 中获得的两条cRNA的端口添加均聚物(A)或(G)，然后对载体的端口添加均聚物(T)或(C),cRNA和末端和载体RNA末端退火后粘连，转化为重组分子；

S4：将S3中获得的重组分子经过基因培养转化后成为宿主细胞，将宿主细胞放置在琼脂平板上，通过琼脂平板中添加相应的筛选物质，直接鉴别筛选所含重组子的菌落。

优选的，S1中的低盐缓冲液和洗脱缓冲液均放置在玻璃材质的烧杯和试管内部，烧杯和试管的表面均通过高温焙烤，且烧杯和试管的表面均涂抹有 0.1％焦碳酸二乙酯，在mRNA的反应中添加核酸酶抑制剂，避免mRNA酶对mRNA 进行降解。

优选的，S2中第一条cRNA链的引物为六核苷酸引物，杂合分子中的RNA 链通过碱溶液水解，引物与RN A样品在反应前混合预热至60°，反转录酶催化时需温育7min。

优选的，低盐缓冲液和洗脱缓冲液均通过煮沸过的冷却水配置，冷却水均通过焦碳酸二乙酯处理。

优选的，S2中的反应温度为37°，S1中的磁分离器为电磁铁，当电磁铁通电时磁分离器的磁感应强度增加，继而对磁性球珠进行吸附。

(三)有益效果

与现有技术相比，本发明提供了一种高效构建cDNA文库的方法，具备以下有益效果：