[发明专利]一种降低毕赤酵母表达外源蛋白氧化修饰的方法

权利要求书

1.一种降低毕赤酵母表达外源蛋白氧化修饰的方法，其特征在于以甲醇作为诱导剂和碳源的诱导表达阶段，混合补加山梨醇将毕赤酵母甲醇代谢中的甲醛异化途径转移至TCA途径；

其中，甲醇诱导阶段的菌体浓度OD600为225-275，以0.6-1.2mL/h/L初始发酵体积的速率流加山梨醇。

2.如权利要求1所述降低毕赤酵母表达外源蛋白氧化修饰的方法，其特征在于所述甘油培养阶段的操作如下：控制温度30±1℃、pH5.0±0.2，根据实际情况调节搅拌转速和空气流量，必要时通入纯氧控制溶氧在10％以上，经过约10-18h培养，培养基中甘油耗完，出现溶氧峰后，按11.1mL/h/L-19.4mL/h/L初始发酵体积补入甘油补料，OD达225-275，停止流加，进入诱导阶段。

3.如权利要求1所述降低毕赤酵母表达外源蛋白氧化修饰的方法，其特征在于所述诱导表达阶段按以下方案流加甲醇：

诱导0-5h，2.96-3.71mL/h/L初始发酵体积，

诱导5-10h，4.78-5.71mL/h/L初始发酵体积，

诱导10-16h，6.22-7.76mL/h/L初始发酵体积，

诱导16-36h，7.81-9.3mL/h/L初始发酵体积，

诱导36h-放罐，9.71-12.3mL/h/L初始发酵体积。

4.如权利要求1所述降低毕赤酵母表达外源蛋白氧化修饰的方法，其特征在于所述诱导表达阶段还包括甲醇适应后一次性补加PTM1微量元素，同时以4.11-4.37mL/h/L初始发酵体积恒速流加YP补料氮源；诱导48h再次一次性补加PTM1微量元素。

5.如权利要求1所述降低毕赤酵母表达外源蛋白氧化修饰的方法，其特征在于所述诱导表达阶段控制温度为25±1℃、pH值为5.3-6.0、溶氧≥10％。

6.一种山梨醇在降低毕赤酵母表达外源蛋白氧化修饰中的用途，其特征在于所述山梨醇通过与甲醇混补将毕赤酵母甲醇代谢中的甲醛异化途径转移至TCA途径，所述山梨醇在甲醇诱导开始16h后，以0.6-1.2mL/h/L初始发酵体积的速率流加山梨醇。

7.如权利要求6所述山梨醇在降低毕赤酵母表达外源蛋白氧化修饰中的用途，其特征在于按以下方案流加甲醇：

诱导0-5h，2.96-3.71mL/h/L初始发酵体积，

诱导5-10h，4.78-5.71mL/h/L初始发酵体积，

诱导10-16h，6.22-7.76mL/h/L初始发酵体积，

诱导16-36h，7.81-9.3mL/h/L初始发酵体积，

诱导36h-放罐，9.71-12.3mL/h/L初始发酵体积。