[发明专利]一种降低毕赤酵母表达外源蛋白氧化修饰的方法

说明书

为解决毕赤酵母重组发酵生产外源蛋白翻译后过度修饰的技术问题，本公开提供一种降低毕赤酵母表达外源蛋白氧化修饰的方法，其特征在于以甲醇作为诱导剂和碳源的诱导表达阶段，混合补加山梨醇将甲醇代谢中的甲醛异化途径转移至TCA途径；其中，甲醇诱导阶段的菌体浓度OD600为225‑275，以0.6‑1.2mL/h/L初始发酵体积的速率流加山梨醇。通过混补山梨醇甲醇减少了外源蛋白MW05的异常修饰，特别是氧化修饰。

技术领域

本发明属于生物技术和发酵工程领域，具体涉及一种降低毕赤酵母表达外源蛋白氧化修饰的方法，特别是涉及利用山梨醇/甲醇混合流加技术和低温甲醇诱导技术降低毕赤酵母表达外源蛋白氧化修饰的方法。

背景技术

毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统已经发展成为一个成熟的外源蛋白表达系统，毕赤酵母菌作为一种单细胞真核生物，既具有原核生物结构简单遗传背景清楚的特点，又具有真核生物严格的基因调控机制和对表达产物的翻译后修饰的能力，自身不含有内毒素、热源、病原体，是一种非常安全的表达宿主，已经成为最有效的表达外源蛋白的表达系统之一。据文献资料统计已有数千种外源蛋白已经实现了在毕赤酵母体系中成功表达，其中有很多已经实现了大规模工业化生产。近些年，毕赤酵母被美国FDA认定为GRAS(Generally recognized as safe)，为其在食品及医药上应用铺平了道路。毕赤酵母表达外源蛋白具有表达量高、稳定性好、培养成本低和产物易分离纯化等优点，适于大体积高密度连续发酵，具有强且易控的醇氧化酶(Alcohol oxidase，AOX)启动子等优点，可严格控制外源基因的表达。

毕赤酵母高密度流加培养生产表达外源蛋白过程一般由前期细胞培养和后期诱导表达两个阶段构成。在获取了大量、具有蛋白分泌表达功能的细胞以后，诱导阶段通过合理的甲醇诱导来提高单位体积培养液中的目标蛋白表达水平(活性、效价等)，这是实现大规模、商业化药物蛋白生产的另一个最关键因素。外源蛋白的高效诱导与大量获取功能性生物体同等重要、甚至更加重要。毕赤酵母诱导外源蛋白一般在30℃以下进行，这时，甲醇充当了碳源、能源和诱导剂三重角色，因此，诱导阶段的代谢过程以及相应的蛋白诱导表达的控制也更为复杂。国内外有关诱导阶段重组毕赤酵母发酵控制的研究报道主要集中在甲醇浓度和pH值的最适控制水平、低温诱导以及非限制性碳源与甲醇共混流加进行诱导等几个方面。其中，低温诱导和山梨醇/甲醇共混流加诱导的公认作用就是抑制蛋白酶的分泌、减少目标蛋白的降解、缓解细胞衰亡，对于蛋白质的结构问题关注较少。

毕赤酵母以甲醇作为唯一碳源表达外源蛋白时，通常认为通过甲醛异化途径为提供功能性细胞和目标蛋白的合成提供能量，该途径在为蛋白合成提供能量的同时，中间代谢产物甲醛等脱离过氧化物酶体进入到液胞内，会对细胞产生毒害作用，导致目标蛋白的浓度或活性低、高效表达难以长时间地持续下去；并且毕赤酵母利用甲醇代谢提供能量是一个耗氧量巨大的反应过程，为了取消氧气的供给降低发酵成本，需要减少甲醇的供给。在该种情况下表达蛋白会出现大量不定向的修饰(以氧化修饰为主)，MW05重组蛋白尤为明显，其Cys34存在自由巯基。该基团被氧化后会激发体内的清除机制，缩短其半衰期。从甲醇的代谢途径分析，可能存在的原因是甲醛异化途径中占用了大量的GSH从而影响体内氧化还原水平。

发明内容

为解决毕赤酵母重组发酵生产外源蛋白翻译后过度修饰的技术问题，本公开提供一种降低毕赤酵母表达外源蛋白氧化修饰的方法，其特征在于以甲醇作为诱导剂和碳源的诱导表达阶段，混合补加山梨醇将甲醇代谢中的甲醛异化途径转移至TCA途径；其中，甲醇诱导阶段的菌体浓度OD600为225-275，以0.6-1.2mL/h/L初始发酵体积的速率流加山梨醇。通过混补山梨醇甲醇减少了外源蛋白MW05的异常修饰，特别是氧化修饰。

具体而言：

一方面，本发明提供一种降低毕赤酵母表达外源蛋白氧化修饰的方法，其特征在于以甲醇作为诱导剂和碳源的诱导表达阶段，混合补加山梨醇将毕赤酵母甲醇代谢中的甲醛异化途径转移至TCA途径；