[发明专利]一种利用毕赤酵母大规模生产重组蛋白的工艺

权利要求书

1.一种重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法，包括：

(1)一级种子培养；

(2)二级种子培养；

(3)三级种子培养；

(4)发酵罐甘油培养；

(5)发酵罐甘油流加补料培养；

(6)甲醇诱导培养；

(7)放罐、离心收集、送检；

其特征在于，(4)发酵罐甘油培养步骤中控制温度30±1℃、pH5.0±0.2，通入纯氧控制溶氧在10％以上，经过10-18h培养，培养基中甘油耗完，出现溶氧峰后，进行(5)发酵罐甘油流加补料培养步骤，按11.1mL/h/L-19.4mL/h/L初始发酵体积补入甘油补料，至OD600达225-275。

2.如权利要求1所述重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法，其特征在于：(1)一级种子培养步骤包括将检定合格的种子液以0.05％-0.1％接种量接种至300±6g YPD培养基中，30±1℃，250±5rpm摇床培养，测定OD600至10-20，镜检细胞呈圆形或椭圆形、出芽、无杂菌。

3.如权利要求1所述重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法，其特征在于：(2)二级种子培养步骤包括将摇瓶种子液以8％-12％的接种量接种至含YPD培养基的6.7±0.5kg种子罐中培养，温度控制在30±1℃，通过调节搅拌转速和通气量控制溶氧在20％以上，培养至OD600达25-45，镜检细胞呈圆形或椭圆形、无杂菌。

4.如权利要求1所述重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法，其特征在于：(3)三级种子培养步骤包括将二级种子液以8％-12％的接种量接种至含YPD培养基的63±0.5kg种子罐中培养，温度控制在30±1℃，通过调节搅拌转速和通气量控制溶氧在20％以上，培养至OD600达25-45，镜检细胞呈圆形或椭圆形、无杂菌。

5.如权利要求1所述重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法，其特征在于：(6)甲醇诱导培养步骤包括甘油流加阶段结束后，等溶氧和pH均明显上升后，将温度控制为18-25℃，pH值控制为5.3-6.0，开始以甲醇进行诱导，甲醇适应5h后，一次性补加PTM1 3080±61.6g，诱导48h再次补加PTM1 3080±61.6g，诱导60-72h，进行(7)放罐、离心收集、送检。

6.一种毕赤酵母生产重组蛋白的两阶段发酵法，其特征在于毕赤酵母的发酵罐培养包括两个阶段：菌体增殖阶段和外源蛋白诱导表达阶段；其中菌体增殖阶段以甘油为碳源在30℃实现毕赤酵母中高密度发酵，外源蛋白诱导表达阶段以甲醇为诱导剂在20℃实现外源蛋白的诱导表达。

7.如权利要求6所述毕赤酵母生产重组蛋白的两阶段发酵法，其特征在于所述发酵罐培养为吨级发酵罐，优选2000L发酵罐。