[发明专利]一种利用毕赤酵母大规模生产重组蛋白的工艺

说明书

为解决菌体浓度低，蛋白表达量低，不利于商业化大规模生产的技术问题，本公开提供一种重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法，包括：(1)一级种子培养；(2)二级种子培养；(3)三级种子培养；(4)发酵罐甘油培养；(5)发酵罐甘油流加补料培养；(6)甲醇诱导培养。本发明所述的重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法通过对培养基、溶氧、OD600的优化实现了过程控制简单、易于操作、重复性好的毕赤酵母吨级以上高密度发酵规模的生产。

技术领域

本发明属于生物技术和发酵工程领域，具体涉及一种利用毕赤酵母大规模生产重组蛋白的工艺，特别是涉及通过毕赤酵母高密度发酵技术和甲醇低温诱导表达技术相结合的毕赤酵母大规模生产重组蛋白的方法和应用。

背景技术

毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统已经发展成为一个成熟的外源蛋白表达系统，毕赤酵母菌作为一种单细胞真核生物，既具有原核生物结构简单遗传背景清楚的特点，又具有真核生物严格的基因调控机制和对表达产物的翻译后修饰的能力，自身不含有内毒素、热源、病原体，是一种非常安全的表达宿主，已经成为最有效的表达外源蛋白的表达系统之一。据文献资料统计已有数千种外源蛋白已经实现了在毕赤酵母体系中成功表达，其中有很多已经实现了大规模工业化生产。近些年，毕赤酵母被美国FDA认定为GRAS(Generally recognized as safe)，为其在食品及医药上应用铺平了道路。毕赤酵母表达外源蛋白具有表达量高、稳定性好、培养成本低和产物易分离纯化等优点，适于大体积高密度连续发酵，具有强且易控的醇氧化酶(Alcohol oxidase，AOX)启动子等优点，可严格控制外源基因的表达。

在重组毕赤酵母在放大到吨级以上的发酵规模后，存在搅拌、通气等条件要求苛刻的情况，并伴随有耗氧量和产热量巨大等缺点，难以真正大规模工业化生产。现有技术中规模化培养毕赤酵母通常采用BSM培养基实现大规模高密度发酵生产重组蛋白。基于BSM培养基的发酵工艺通常包括种子培养、甘油培养、甘油补料、甲醇补料诱导的不同阶段，在甘油补料阶段一般向发酵罐中添加50％浓度灭菌甘油作为碳源，诱导阶段以100％的甲醇作为碳源，甘油粘稠称量配料过程操作较为麻烦，大规模工业化生产成本较高，诱导阶段单纯补充甲醇，使毕赤酵母细胞生长缓慢，整个发酵周期长，毕赤酵母细胞难以快速达到高密度发酵水平。此外，在毕赤酵母高密度发酵的中后期，毕赤酵母容易出现菌体老化、自溶、蛋白酶分泌量增加等情况，从而导致重组蛋白出现降解，蛋白表达量大幅度衰减的现象。

发明内容

为解决菌体浓度低，蛋白表达量低，不利于商业化大规模生产的技术问题，本公开提供一种重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法，包括：(1)一级种子培养；(2)二级种子培养；(3)三级种子培养；(4)发酵罐甘油培养；(5)发酵罐甘油流加补料培养；(6)甲醇诱导培养。本发明所述的重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法通过对培养基、溶氧、OD600的优化实现了过程控制简单、易于操作、重复性好的毕赤酵母吨级以上高密度发酵规模的生产。

具体而言：

一方面，本发明提供一种重组蛋白在毕赤酵母中高密度发酵方法，包括：

(1)一级种子培养；

(2)二级种子培养；

(3)三级种子培养；

(4)发酵罐甘油培养；

(5)发酵罐甘油流加补料培养；

(6)甲醇诱导培养；

(7)放罐、离心收集、送检；

其特征在于，(4)发酵罐甘油培养步骤中控制温度30±1℃、pH5.0±0.2，通入纯氧控制溶氧在10％以上，经过10-18h培养，培养基中甘油耗完，出现溶氧峰后，进行(5)发酵罐甘油流加补料培养步骤，按11.1mL/h/L-19.4mL/h/L初始发酵体积补入甘油补料，至OD600达225-275。