[发明专利]快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒及制法

权利要求书

1.快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒，其特征在于：包括引物与探针的序列是：

上游引物P1：5’-GGTGCTGGCCTCCAACAG-3’；

下游引物P2：5’-GGTGGGCTCAGGTGATAGAGACT-3’；

探针P3：5’-CATTCACCCACTAAACCCCCTAGAAGTCCC-3’。

2.根据权利要求1所述的快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒，其特征在于：所述探针P3的5’端标记fam基团，3’端标记temra基团。

3.根据权利要求1所述的快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括由其他试剂所组成的反应体系如下表1：

表1快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒的反应体系

4.根据权利要求1至3任一所述的快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的扩增反应条件：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火延伸40s，40个循环。

5.一种根据权利要求1至3任一所述的快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒的应用，其特征在于：利用所述试剂盒对食品、中药材及保健品中梅花鹿源性成分进行定量PCR特异性检测。

6.根据权利要求5所述的快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒的应用，其特征在于：所述梅花鹿源性成分定量PCR特异性检测方法为：

采用梅花鹿物种实时荧光PCR特异性检测体系进行实时荧光PCR扩增梅花鹿的Cytb基因，以Taq DNA聚合酶进行PCR反应，当DNA链延伸到梅花鹿物种特异性检测探针位置时，以Taq DNA聚合酶的5’端外切酶活性切断梅花鹿物种特异性检测探针的淬灭基团，使梅花鹿物种特异性检测探针发出荧光信号，经信号收集处理，获得特异性扩增曲线。

7.一种根据权利要求1至3任一所述的快速检测梅花鹿源性鹿产品的定量PCR试剂盒的制法，其特征在于：具体包括以下步骤：

第一步 引物与探针的设计：

(1)根据NCBI基因数据库已注释的梅花鹿Cytb基因序列,用DNAMAN软件比对分析梅花鹿和马鹿、驯鹿、赤鹿、白臀鹿、驼鹿等亲缘性近的物种的序列,选择梅花鹿序列中特异位点较多的片段作为靶序列,应用Primer Express 3.0软件设计一对特异性引物P1、P2和一条特异性的探针P3，双标记探针的5’端标记报告基因羧基荧光素FAM,3’端标记淬灭基团羧基四甲基罗丹明TAMRA；

(2)引物与探针序列

上游引物P1:5’-GGTGCTGGCCTCCAACAG-3’

下游引物P2:5’-GGTGGGCTCAGGTGATAGAGACT-3’

探针P3:5’fam-CATTCACCCACTAAACCCCCTAGAAGTCCC-temra 3’

第二步 扩增反应条件：分别对荧光PCR的引物、探针浓度、dNTPS浓度、及PCR的退火温度、时间、循环参数等进行优化，筛选出PCR扩增的最佳反应体系如表1；

扩增反应条件：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火/延伸40s，40个循环；

第三步 特异性检测：将实验室自行采集保存，以及其他研究院所惠赠的梅花鹿、马鹿、牛和羊源性15份组织样品由实验室新建立的定量PCR方法检测；结果样品1、3、5、7、9、11号样品梅花鹿源性成分检测结果为阳性，2、4、6、8、10、12、13、14、15样品梅花鹿源性成分检测结果为阴性，实验室定量PCR检测结果与提供给定值一致，说明本方法特异性良好；

第四步 灵敏度检测：将含有浓度7.8×10⁷pg/μL的梅花鹿DNA质粒进行连续10倍梯度稀释成8个梯度进行实时荧光PCR扩增，并设置重复；以Ct值37为下限判定该方法的灵敏性；根据检测结果确定方法的灵敏度，检测灵敏度在DNA水平上可达到10pg/μL；

第五步 重复性和稳定性检测：以10倍梯度稀释已知拷贝数的质粒为模板,在LightCycle荧光定量PCR仪上检测,得到动力学曲线,并计算出相应的标准曲线；根据检测结果绘制扩增标准曲线,斜率为-3.2111，相关系数为0.9985。试验结果说明检测试剂盒具有良好的重复性和稳定性；

第六步 临床样品检测：将通过多种方式收集的梅花鹿、马鹿、牛和羊源性组织样品15份、鹿血45份、鹿茸鹿角等中药材样品12份样品采用新检测试剂盒进行定量PCR检测，同时采用高丽君，何程远等《基于双重PCR技术的鹿茸及其伪品DNA指纹特征和鉴定》(吉林大学学报)2018，44中的PCR方法作为对照，结果完全一致。