[发明专利]一株表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌工程菌株及其应用

说明书

一种高效分泌表达D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的食品安全级菌株，其特征在于，该菌株属于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），已于2021年5月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22577。利用该菌株发酵生产D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶，可以直接将酶分泌到细胞外，产酶量高，且宿主杂蛋白较少，发酵粗酶液可直接用于果糖的转化反应或与载体结合制备固定化酶，产酶工艺简单，成本低；菌株发酵过程中无需添加抗生素，目的基因的表达无需添加诱导剂，D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的生产达到食品安全级。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，提供了一种高效分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的菌株，尤其是食品安全级菌株，以及利用所述菌株发酵生产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的方法。

背景技术

D-阿洛酮糖（D-allulose）是D-果糖碳-3位置的差向异构体，其甜度是蔗糖的70%，口感和特性与蔗糖非常类似，但热量只有0.4 kcal/g,同时具有改善脂质代谢、降低餐后血糖、抗糖尿病、抗肥胖等特殊生理功能，因此D-阿洛酮糖是蔗糖的理想替代品。相关研究还表明D-阿洛酮糖可通过竞争性抑制转运蛋白的进出，减少机体对膳食中果糖和葡萄糖的吸收；通过诱导GLP-1的释放，激活迷走神经传入信号以限制摄食和高血糖。美国食品与药物管理局（FDA）于2011年将D-阿洛酮糖认证为GRAS（Generally recognized as safe），并于2019年发表公告将其排除在添加糖和总糖成分表之外。D-阿洛酮糖可用作肥胖和糖尿病人的代糖，也可作为健康人群的理想甜味剂，在食品、保健品等领域具有广阔的应用前景。

目前D-阿洛酮糖的主要生产方法是酶转化法，即利用阿洛酮糖 3-差向异构酶（或塔格糖 3-差向异构酶）将果糖转化为D-阿洛酮糖，已经有大量微生物来源的阿洛酮糖 3-差向异构酶被发现和报道。同时利用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌等宿主菌为出发菌株，构建了异源表达阿洛酮糖 3-差向异构酶的工程菌株。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）不会产生内毒素和致热致敏蛋白，且具有高效的蛋白表达和分泌能力，是发酵生产食品用酶的理想宿主菌。中国专利CN104894047B基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记以B. subtilis 1A751为宿主菌构建表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶表达菌株，发酵液总酶活达16U/mL。中国专利CN108102995B构建生产D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌工程菌株，发酵48h胞内酶活最高178 U/mL。

大多数D-阿洛酮糖 3-差向异构酶在枯草芽孢杆菌中为胞内表达，该目标蛋白不能分泌到胞外。这就需要利用全细胞转化方式进行阿洛酮糖的生产，细胞组分会对后续产品分离纯化及结晶带来一定影响。中国专利CN105602925B证实了来源于瘤胃菌（Ruminococcus sp.）的D-阿洛酮糖3-差向异构酶（RDPE）在枯草芽孢杆菌表达时能够借助非经典分泌途径高效地分泌到胞外，发酵液可直接用于转化。中国专利CN105602879B构建了高效分泌RDPE的枯草芽孢杆菌工程菌株，RDPE的分泌水平最高可以达到95 U/mL。D-阿洛酮糖3-差向异构酶分泌表达水平的进一步提高，有助于提升发酵效率，降低阿洛酮糖的生产成本。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的食品安全级菌株，所述菌株分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶水平高，发酵简单可控，易于放大生产。为达此目的，本发明采用以下技术方案。