[发明专利]一种从河豚毒素生产的副产物中分离制备四种高纯度多不饱和脂肪酸单体的方法

权利要求书

1.一种高效的从生产河豚毒素的副产品 - 河豚内脏油中分离制备四种多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将河豚鱼内脏组织切碎、匀浆，用80-90%乙醇提取河豚毒素，提取液真空减压浓缩除去乙醇，得提取物。提取物用醋酸乙酯萃取其中的油，将醋酸乙酯相减压浓缩除去溶剂，所得物即为河豚内脏油，为本发明用于分离制备四种多不饱和脂肪酸的原料。

（2）将上述（1）中所得的河豚鱼内脏油用适量的低极性有机溶剂溶解，用纯水洗涤多次，弃去水相，得河豚鱼内脏精制油。

（3）上述（2）中得到的河豚鱼内脏油精制油用碱水充分萃取，使油水解和脂肪酸皂化。将萃取后的碱水液调pH至酸性，用低极性有机溶剂萃取其中的脂肪酸。减压蒸馏回收有机溶剂，得河豚鱼内脏脂肪酸。

（4）上述（3）中得到的河豚内脏脂肪酸用硅胶柱层析分离，用低极性到高级性有机溶剂梯度洗脱，各洗脱相用TLC进行分析，合并成分相同的洗脱相。得到富集的多不饱和脂肪酸。

（5）上述（4）中得到富集的多烯不饱和酸经HPLC分析，主要含有ARA、EPA、DPA和DHA四种多不饱和脂肪酸。用制备型HPLC将四种多烯不饱和脂肪酸分离、分别收集和制备四种多烯不饱和脂肪酸单体。制备的单体化合物经HPLC分析其含量均达到99%以上。

2.如权利要求1所述的高效的从河豚鱼内脏油中分离制备多不饱和脂肪酸单体的方法，其特征在于：本发明为多不饱和脂肪酸，特别是DPA的制备开发了一种新的高含量的原料来源。

3.如权利要求1所述的从河豚鱼内脏油中分离制备多烯不饱和脂肪酸单体的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述河豚鱼内脏油可为河豚鱼的卵、卵巢、肝脏、脂肪组织或其它内脏组织中提取的油。

4.如权利要求1所述的从河豚鱼内脏油中分离制备多烯不饱和脂肪酸单体的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的河豚鱼内脏油用适量的低极性有机溶剂溶解，其低极性有机溶剂为与水不相混溶的各种有机溶剂，包括但不限于正己烷、石油醚、汽油、醋酸乙酯等。用1-2倍体积的纯水萃取洗涤1-3次，将水溶性成分彻底洗脱干净。

5.如权利要求1所述的高效的从河豚鱼内脏油中分离制备多烯不饱和脂肪酸单体的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述的碱水为1摩尔的氢氧化钠或氢氧化钾。把碱水相和有机相分离。萃取后的碱水相用5摩尔盐酸调节pH至3.0，用低极性有机溶剂（如石油醚或醋酸乙酯等与水不相互溶的有机溶剂）将脂肪酸萃取出来，减压蒸馏除去有机溶液，得带河豚鱼内脏脂肪酸。

6.如权利要求1所述的高效的从河豚鱼内脏油中分离制备多烯不饱和脂肪酸单体的方法，其特征在于：步骤（4）所述，河豚鱼内脏脂肪酸用硅胶柱层析分离，先后用石油醚和石油醚：乙酸乙酯：乙酸（100: 2: 0.2，V/V/V）洗脱。洗脱液各相用TLC分析，合并成分相同的洗脱相。得到含多烯不饱和脂肪酸的洗脱相。

7.如权利要求1所述的高效的从河豚鱼内脏油中分离制备多烯不饱和脂肪酸单体的方法，其特征在于：步骤（5）所述分析型HPLC为岛津LC-2030C 3D Plus高效液相色谱仪或其它厂家类似的HPLC仪器。色谱柱YMC-Pack ODS-A (4.6 x 250 mm)或其类似的分离柱。流动相为1%乙酸：乙腈（20:80，v/v），检测波长195 nm。制备型HPLC为依利特P3500制备型高效液相色谱或其类似的制备型高效液相色谱仪，UV3100紫外-可见检测器。制备色谱柱为YMC-PackODS-A (50 x 250 mm)或其类似的制备柱。以1%乙酸：乙腈（20:80，v/v）为流动相，检测波长195 nm，进样量1.0 mL。收集四种的四种多不饱和脂肪酸，分别减压蒸馏除去溶剂，得到4种多不饱和脂肪酸单体。四种多不饱和脂肪酸ARA、EPA、DPA和DHA用市售标准物质进行定性鉴定，用标准物质制作定量标准曲线进行定量测定。制备的单体化合物经分析性HPLC检测，含量均达到99%以上。