[发明专利]间作玉米下花生叶片基因差异表达的比较转录组分析方法

权利要求书

1.间作玉米下花生叶片基因差异表达的比较转录组分析的引物组的获取方法，其特征在于，所述方法为：

(1)培育花生参试材料：参试材料包括玉米与花生间作的实验组花生功能叶和单独种植花生的对照组花生功能叶；

(2)提取步骤(1)实验组和对照组两组花生功能叶的RNA；构建cDNA文库；

(3)对构建的文库进行测序、质量控制获得高质量的序列信息；

(4)将步骤(3)获得的序列信息与两个二倍体祖先野生种花生的全基因组序列进行比对，获取在参考基因组的位置信息，获得Mapped reads和非Mapped reads，基于Mappedreads进行后续生物信息学分析；

(5)通过Mapped reads在参考基因组上的位置信息，使用Cufflinks软件的Cuffquant和Cuffnorm组件，采用FPKM法对样品转录本和基因的表达水平进行定量，将差异倍数≥2且错误发现率0.01作为差异表达基因的筛选标准，并根据相对表达量将其划分为上调基因和下调基因，同时对差异基因进行GO、KEGG和COG多种数据库功能注释和富集分析；

(6)基于参考基因组序列，使用Cufflinks软件对Mapped reads进行拼接，通过过滤掉编码少于50个氨基酸残基的过短肽链或只包含单个外显子的序列，并与参考基因组注释信息进行比较，寻找未被注释的转录区，使用BLAST软件将发掘的新基因与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、Pfam和KEGG数据库进行序列比对，使用KOBAS2.0得到新基因的KEGGOrthology结果；预测完新基因的氨基酸序列之后使用HMMER软件与Pfam数据库比对，获得新基因的注释信息；

(7)根据比较转录组测序结果，有针对性地挑选与碳氮代谢、氨基酸代谢、脂类代谢、糖代谢和叶绿素代谢及植物激素信号转导和植物与病原菌互作相关的差异表达基因以及核糖磷酸-3-差向异构酶和甘油-3-磷酸-2-O-酰基转移酶这两个代谢重要基因，以Actin11为内参基因，设计得到相应引物组，

所述步骤(1)的花生功能叶选自花生荚果膨大期；

所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.36所示；

所述玉米与花生间作的实验组其所用玉米品种为桂单0810；所用花生品种为桂花836；

所述GO数据库差异表达基因的功能注释通过了KS＜0.05筛选。

2.对应用如权利要求1所述方法得到的引物组进行qRT-PCR验证的方法，其特征在于，所述方法为：提取花生功能叶的RNA，合成cDNA第一链，稀释20倍后的cDNA第一链作为qRT-PCR的扩增模板，使用2^-ΔΔCt法计算样品差异基因的相对表达量；

所述qRT-PCR反应中，核苷酸序列SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2为内参基因Actin 11引物对；

核苷酸序列SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.36为17个重要代谢基因引物对。