[发明专利]一种连续制备酶切超低分子量透明质酸或其盐的方法有效
| 申请号： | 202110767111.5 | 申请日： | 2021-07-07 |
| 公开（公告）号： | CN113493776B | 公开（公告）日： | 2022-06-14 |
| 发明（设计）人： | 廉少杰;刘磊;康传利;张美霞;杜帅;王清;李庆 | 申请（专利权）人： | 山东焦点福瑞达生物股份有限公司 |
| 主分类号： | C12N9/26 | 分类号： | C12N9/26;C12P19/26;C12P19/14;C12R1/01 |
| 代理公司： | 山东华君知识产权代理有限公司 37300 | 代理人： | 李欣 |
| 地址： | 273100 山东*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 连续 制备 酶切超低 分子量 透明 方法 | ||
1.一种连续制备酶切超低分子量透明质酸或其盐的方法，其特征在于，包括制备粗酶液、酶解浓缩、分离提取；
所述酶解浓缩为取透明质酸粗酶液和透明质酸发酵液混合于膜浓缩反应器中，控制酶解温度35-45℃，搅拌速度为90-100rpm，pH为7.1-8，酶解1.8-2.2h后，先使用陶瓷膜过滤，过滤至溶液澄清，继续酶解3.5-4.5h，然后经有机膜过滤后继续酶解，每间隔18-22min经有机膜过滤浓缩，待经有机膜过滤至溶液澄清透明后，得到最终滤液；
所述透明质酸粗酶液为将保藏编号为CGMCC NO.18661的肠杆菌CGJ001培养制得含透明质酸酶的菌液；然后取制得的含透明质酸酶的菌液离心，向离心液上清液中等体积加入PBS溶液，得到重悬菌体；将重悬菌体进行超声细胞破碎后制得透明质酸粗酶液，酶活性为8100-8200U/ml；
所述透明质酸发酵液中透明质酸的分子量为200-250KD，透明质酸含量是10-15g/L；
所述透明质酸粗酶液与透明质酸发酵液的体积比为1:100-1000；
所述有机膜的过滤精度为50-100KD；所述陶瓷膜的过滤精度为1KD-70KD；
所述分离提取，将最终滤液在85-95℃下保温处理8-12min后，使用次氯酸钠溶液进行脱色处理，脱色过程中保持溶液的pH=3.5-4.5，脱色时间为1.8-2.2h，脱色处理结束后将pH值调至6.5-7.5，然后经液体无菌过滤器过滤后输送至冷冻干燥机进行冷冻干燥，待干燥结束，得到透明质酸产品；
所述冷冻干燥过程分为阶段一、阶段二、阶段三、阶段四、阶段五、阶段六、阶段七；
其中，阶段二、阶段三、阶段四、阶段五、阶段六、阶段七是在真空条件下进行冷冻干燥，真空度为25Pa；
阶段一的温度为-28℃到-32℃，时间为3.5-4.5h；阶段二的温度为-18℃到-22℃，时间为1.5-2.5h；阶段三的温度为-7℃到-3℃，时间为1.5-2.5h；阶段四的温度为-2℃到2℃，时间为3.5-4.5h；阶段五的温度为3-7℃，时间为1.5-2.5h；阶段六的温度为18-22℃，时间为1.5-2.5h；阶段七的温度为28-32℃，时间为8-12h。
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