[发明专利]一种连续制备酶切超低分子量透明质酸或其盐的方法

说明书

一种连续制备酶切超低分子量透明质酸或其盐的方法，包括制备粗酶液、酶解浓缩、分离提取；所述酶解浓缩，取透明质酸粗酶液和发酵液混合于膜浓缩反应器中，控制酶解温度35‑45℃，搅拌速度为50‑100rpm，pH为7.1‑8，酶解1.8‑2.2h后，先使用陶瓷膜过滤，然后在有机膜浓缩过程中连续酶解，得到最终滤液；本发明制备的透明质酸的分子量最低能达到1000Da，降解的范围能达到1KD‑70KD,突破了现有酶解法制备的分子量范围，尤其是实现了寡糖的超低分子量；在提取时使用冷冻干燥技术，制备的透明质酸或其盐在溶解性，生物活性，分子量分布，产品色泽等方面远远优于其他工艺制备的产品。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种连续制备酶切超低分子量透明质酸或其盐的方法。

背景技术

透明质酸（HA），又名玻尿酸，在牛眼玻璃体中分离出来的一种糖胺聚糖类多糖，其独特的分子结构和理化性质，赋予其具有优秀的保湿性、粘弹性和生物相容性等特性，目前已广泛应用于化妆品、保健食品、药品等领域。透明质酸是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖通过糖苷键连接而成的双塘重复单位组成。电子显微镜下观察HA为一线性单链，在水溶液中扩展成随机的线圈状。HA分子中每一双糖单位均含有一个羧基，在生理条件下均可解离成负离子，等空间距离负离子的相互排斥使其分子在水溶液中处于松展状，占据了大量空间，可结合多于本身1000倍的水。随着近年来HA的研究不断深入，发现HA通过作用于细胞与细胞质中的HA受体，调节细胞功能，在组织生成和修复、肿瘤侵袭等过程中发挥重要作用。特别是低分子透明质酸，由于具有较好的渗透性，吸收更好，在食品、化妆品、药品领域均有广泛应用。

近年来低分子HA和HA寡糖的研究与应用兴起，国内外对降解方法及其降解产物的制备研究逐年增多。目前，HA降解的方法主要有物理降解、化学降解、生物降解3大类。物理降解法一般采用机械、辐照或超声的方式，但是使分子量降低的程度有限。化学降解一是会造成环境污染，能耗高；二是容易破坏该类生物大分子的结构，比如糖链上糖苷键的断裂，乙酰基的水解，单糖六元环的断裂等，从而对该类物质的生物活性造成影响；三是引入的小分子物质不易在后续提取过程中去除，影响产品的品质。酶解法是目前公认的温和，环境友好型生产技术。

专利CN102876748B公开了用酶解法生产透明质酸，但其局限性比较明显，一是用成品的透明质酸或其盐与酶液反应，不仅使用大量的有机溶剂，增加碳排放，收率低，也是在透明质酸成品的基础上继续降解，生产周期继续延长，是导致现有低分子量透明质酸或盐的产品价格昂贵，成本居高不下的主要原因。二是该专利中制备成品的分子量范围在3kda-10⁴kda，范围较窄，适用范围明显受限，并且不能制备出3kDa以下的透明质酸。

专利CN109897876B公开了用酶解法生产透明质酸或其盐，缺点有：一是要求透明质酸或其盐分子量500kda-700kda，且制得的成品的分子量介于1kda-60kda，该酶解工艺范围严格受限，应用范围较窄，前处理程序较多，工业可行性较低；二是其提取工艺中低温喷雾干燥技术制备成品，由于透明质酸或其盐的商业成品是白色或类白色粉末，喷雾干燥塔制备过程极易产生黑点，而且低分子量的透明质酸经喷雾干燥后易变黄，直接影响成品品质，不适用于低分子量的透明质酸或其盐。

专利CN108220364B公开了一种固液双相酶解与超滤联用制备超低分子量透明质酸寡糖及其盐的方法，此专利除了具有上述已有的缺点，还具有的缺点有：一是酶解缓冲液中引入氧化锆这种物质，该物质里面的杂质对于成品的质量有影响，不论是从食品安全因素角度，还是药品杂质谱的演化分析方面，包括在后续的检测分析中增加了检测成本；二是其固液双相酶解体系转变成液液单向体系过程中耗时较长，从其酶解条件分析该多糖类的料液按照该方法处理，极易造成染菌，对产品质量造成不可挽回的损失；三是其需要利用活性炭吸附，该方法极易造成漏炭的风险，对产品的质量带来安全隐患。

发明内容