[发明专利]一种永生化猪巨噬细胞株及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种永生化猪巨噬细胞株，命名为pBMDM-JY05，该永生化猪巨噬细胞株pBMDM-JY05于2021年5月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2021128。

2.权利要求1所述的永生化猪巨噬细胞株的构建方法，其包括以下步骤：

S1：用GM-CSF因子刺激猪骨髓细胞，获得原代猪骨髓源性巨噬细胞；

S2：用分别携带SV40LT基因和hTERT基因的慢病毒共感染步骤S1获得的原代猪骨髓源性巨噬细胞，获得慢病毒感染的猪巨噬细胞；

S3：培养步骤S2获得的慢病毒感染的猪巨噬细胞7～10天，对增殖的细胞进行亚克隆和连续传代，获得一系列永生化细胞株；

S4：分别利用步骤S3获得的一系列永生化细胞株对非洲猪瘟病毒进行培养，并对培养获得的病毒液的滴度进行检测，以病毒滴度高的病毒液所对应的永生化细胞株作为易感非洲猪瘟病毒的永生化猪巨噬细胞株；其中所述病毒滴度高是指病毒滴度为10^5.0 TCID₅₀/mL或更高。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其中所述病毒滴度高是指病毒滴度为10^6.5 TCID₅₀/mL或更高。

4.根据权利要求2或3所述的构建方法，步骤S1中所述用GM-CSF因子刺激猪骨髓细胞的操作为：在37±0.5℃，5％CO₂条件下使用含有10～20% FBS、5～15 ng/mL GM-CSF、50～150U/mL青霉素、0.05～0.15 mg/mL链霉素、0.20～0.30 μg/ml两性霉素B的RPMI1640培养基培养猪骨髓细胞，得到的分化好的猪骨髓源性巨噬细胞即为原代猪骨髓源性巨噬细胞。

5.根据权利要求2或3所述的构建方法，步骤S2中所述SV40LT基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示，所述hTERT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，两种慢病毒的感染MOI分别均为10～100。

6.复制非洲猪瘟病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

T1：培养权利要求1所述的永生化猪巨噬细胞株，获得永生化猪巨噬细胞群；

T2：使步骤T1获得的永生化猪巨噬细胞群与非洲猪瘟病毒接触；和

T3：使所述非洲猪瘟病毒复制。

7.根据权利要求6所述的方法，T1中所述培养的条件与使用原代猪骨髓源性巨噬细胞培养非洲猪瘟病毒的条件一致，为：在37±0.5℃，5％CO₂条件下使用含有10～20% FBS、5～15 ng/mL GM-CSF、50～150 U/mL青霉素、0.05～0.15 mg/mL链霉素、0.20～0.30 μg/ml两性霉素B的RPMI1640培养基培养。

8.一种非洲猪瘟病毒疫苗，其由权利要求6或7所述的方法获得的非洲猪瘟病毒复制病毒液与疫苗佐剂混合制备得到；

其中所述非洲猪瘟病毒为敲除非洲猪瘟病毒野生毒株ASFV GZ2018的Lectin、CD2v和MGF360的编码基因的基因缺失毒株。

9.根据权利要求8所述的非洲猪瘟病毒疫苗，其中所述非洲猪瘟病毒疫苗是活减毒形式或灭活形式。